灵芝多糖对斑马鱼存活、发育和衰老的影响

夏广清，姚慧敏，董丽红，刘 伟

(通化师范学院1.生命科学学院；2.制药与食品科学学院；3.化学学院，吉林通化 134002)

灵芝多糖对斑马鱼存活、发育和衰老的影响

夏广清1，姚慧敏2，董丽红3，刘 伟1

(通化师范学院1.生命科学学院；2.制药与食品科学学院；3.化学学院，吉林通化 134002)

目的 观察灵芝多糖对斑马鱼存活、发育和衰老的影响。方法 取正常受精的斑马鱼卵,在其单细胞发育期注射二胺吗啉代寡核苷酸(MO),制备p53基因敲除斑马鱼模型。正常斑马鱼卵和p53基因敲除斑马鱼卵孵育8 h后,分别加入灵芝多糖1,2和3 g·L－1于28℃继续培养3 d,测定斑马鱼存活率和畸形率,并用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法分析斑马鱼细胞SA-β-gal染色阳性率,用逆转录PCR检测衰老相关基因端粒酶逆转录酶基因(TERT)、抑癌基因p53、小鼠双微体基因(mdm2)和p21基因表达。结果 灵芝多糖1和2 g·L－1培养3 d对野生型斑马鱼的发育无明显影响,3 g·L－1时大部分野生型斑马鱼胚胎细胞表现为畸形,并且存活率仅为48.6%；灵芝多糖1～3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼的存活和发育无明显影响。灵芝多糖2 g·L－1处理3 d,野生型斑马鱼SA-β-gal染色阳性率与对照组相比明显降低(P＜0.01),p53基因敲除斑马鱼SA-β-gal染色阳性率无明显变化。逆转录PCR结果表明,灵芝多糖2 g·L－1可降低野生型斑马鱼细胞p21和p53基因表达(P＜0.05,P＜0.01),对TERT和mdm2基因表达无明显影响；对p53基因敲除斑马鱼TERT,mdm2,p21和p53基因表达均无明显影响。结论 灵芝多糖2 g·L－1对野生型斑马鱼胚胎细胞复制性衰老具有改善作用,≥3 g·L－1时可导致野生型斑马鱼幼胚发育畸形和死亡。灵芝多糖对斑马鱼衰老的改善作用可能与其降低p21和p53基因表达有关。

灵芝多糖；斑马鱼；衰老

灵芝多糖(ganoderma polysaccharides)存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中，是灵芝所含的主要化学成分之一[1]。林晓等[2]报道，灵芝多糖对老年大鼠具有抗皮肤衰老的作用。王家鹏等[3]报道，灵芝多糖可延缓大鼠衰老，提高其抗氧化能力，并抑制脂质过氧化物的形成。p53基因作为肿瘤抑制基因，还具有抑制细胞凋亡和细胞衰老等作用[4]。Langheinrich等[5－6]在斑马鱼胚胎期注射二胺吗啉代寡核苷酸(morpholino phosphorodiamidate，MO)构建p53缺陷型胚胎，比较喜树碱对p53缺陷型和正常斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响，结果在p53缺陷型胚胎未见到凋亡细胞出现。因此，本研究通过对比观察灵芝多糖对野生型斑马鱼和p53基因敲除型斑马鱼存活、发育和衰老的影响，为灵芝多糖的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼、药物、试剂和主要仪器

野生型斑马鱼由中国海洋大学生命科学院提供。灵芝多糖购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，多糖含量为97.32%。将灵芝多糖10 mg溶于1 mL孵育鱼卵用的水溶液中，制成10 g·L－1储存液备用。Trizol和RT-PCR试剂盒，大连宝生物有限公司；p53-MO由基因公司合成[7]，碱基序列为GCGCCATTGCTTTGCAAGAATTG；衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase，SA-β-gal)购自美国Sigma公司；与衰老相关基因端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因引物:5′GTGTGTGTGTCCTGGGTAAA3′，5′CAGCCTGAGGTCTAAGAA GATG3′；抑癌基因野生型p53引物:5′GATAGCCTAGTGCGAGCACACTCTT3′，5′AGCTGCATGGGGGGGAT3′；p53敲除型引物:5′GATAGCCTAGTGCGAGCACACTCTT3′，5′AGCTGCATGGGGGGGAA3′；小鼠双微体(murine double minute，mdm2)基因引物:5′GACTACTGGAAGTGTCCCAAAT3′，5′GTCCACTCCATCATCTGTT-TCT3′；p21引物:5′CGGAATAAACGGTGTCGTCT3′，5′CGCAAACAGACCAACATCAC3′；β肌动蛋白引物:5′CCCAGACATCAGGGAGTGAT3′，5′TCTCTGTTGGCTTTGGGATT3′；上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。TP600型PCR扩增仪，日本TaKaRa公司；Nikon体视显微镜，吉林华业有限公司。

1.2 p53基因敲除斑马鱼的制备和鉴定

取正常受精的斑马鱼卵，在其单细胞发育期注射p53-MO，敲除p53基因，8 h后提取正常和注射p53-MO斑马鱼幼胚的基因组DNA，用p53野生型引物和敲除型引物扩增检测p53基因敲除的效果。PCR反应条件为 94℃预热 5 min，随后 94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共25个循环，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3 野生型和p53基因敲除斑马鱼的药物处理

取孵育8 h发育正常的野生型斑马鱼和p53基因敲除斑马鱼幼胚置于24微孔板中，每孔15个幼胚，分别设正常对照、灵芝多糖1，2和3 g·L－1组，每组设3复孔。每天更换1次培养液，连续培养3 d，观察斑马鱼存活率和畸形率，并收集发育正常的斑马鱼进行SA-β-gal染色及基因表达分析。

1.4 斑马鱼存活率和畸形率的测定

灵芝多糖与斑马鱼幼胚培养期间，每天计数存活和畸形的斑马鱼，计算培养3 d后斑马鱼的存活率和畸形率(以斑马鱼生长形态弯曲判断为畸形发育)。斑马鱼存活率(%)＝(存活斑马鱼数/处理斑马鱼总数)×100%；斑马鱼畸形率(%)＝(发育畸形斑马鱼数/处理斑马鱼总数)×100%。

1.5 斑马鱼SA-β-gal染色[8]

取连续处理3 d发育正常的斑马鱼，用PBS洗3～5次，4%多聚甲醛4℃固定1～3 d；PBS洗3～4次，PBS保存1～3 d后，PBS洗1次，加入染色液37℃染色16～24 h，镜下观察染色情况，Image图像处理软件计算染色阳性率。

1.6 逆转录PCR测定斑马鱼衰老相关基因表达

灵芝多糖处理斑马鱼3 d，用Trizol法提取斑马鱼总RNA，逆转录PCR法检测抑癌基因p53，p21，mdm2和TERT表达。PCR反应条件同1.2。PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍片，用凝胶分析图像处理系统进行结果分析。以待测基因条带与β肌动蛋白条带积分吸光度比值表示待测基因相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 p53基因敲除斑马鱼的鉴定

分别用野生型和基因敲除型p53引物对野生型斑马鱼和p53基因敲除型斑马鱼幼胚细胞DNA进行扩增。由图1可见，用野生型p53引物扩增，野生型斑马鱼幼胚细胞p53基因可正常扩增，基因敲除型斑马鱼幼胚细胞p53基因扩增明显减少；用基因敲除型p53引物扩增，野生型斑马鱼幼胚细胞p53基因扩增明显减少，基因敲除型斑马鱼幼胚细胞p53基因扩增明显增加。由此表明，注射p53-MO可以有效地沉默p53基因的表达，可以用于实验研究。

Fig.1 ldentification of zebrafish with p53 gene knockout by PCR analysis.p53-Knockout zebrafish model was established by injecting morpholino phosphorodiamidate into normal zebrafish eggs in the single cell development stage，and genome DNA was extracted 8 h post fertilization both in wild type and p53-knockout zebrafish embryos.Lanes 1－4:wild type zebrafish；lanes 5－8:zebrafish with p53 gene knockout.

2.2 灵芝多糖对野生型和p53基因敲除斑马鱼存活和生长畸形的影响

由表1结果表明，灵芝多糖1和2 g·L－1对野生型斑马鱼发育和存活无明显影响，3.0 g·L－1大部分野生型斑马鱼胚胎死亡，存活率明显降低，(P＜0.01)而且斑马鱼发育延缓，表现出多种畸形状态(图2)，畸形率明显升高(P＜0.01)。灵芝多糖1，2和3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼存活和发育无明显影响(表1，图3)。

Tab.1 Effect of ganoderma polysaccharide(GLP)on survival rate and deformty rate of wild type and p53-knockout zebrafish

Fig.2 Different types of malformation of wild type zebrafish embryos treated with GLP 3 g·L－1for 3 d(×2). A:normal control；B－E:different types of deformed zebrafish.

Fig.3 Effect of GLP treatment for 3 d on development of p53-knockout zebrafish embryos(×2).A:normal control；B:p53-knockout zebrafish embryos control；C，D and E: p53-knockout zebrafish embryos treated with GLP 1，2 and 3 g·L－1，respectively.

2.3 灵芝多糖对野生型和p53基因敲除斑马鱼衰老的影响

野生型斑马鱼SA-β-gal染色结果(图4)表明，灵芝多糖2 g·L－1组胚胎细胞SA-β-gal染色阳性率与对照相比明显降低(P＜0.05)，灵芝多糖1和3 g·L－1对野生型斑马鱼胚胎细胞SA-β-gal染色阳性率无明显影响。p53基因敲除斑马鱼SA-β-gal染色结果显示(图5)，灵芝多糖1，2和3 g·L－1对胚胎细胞SA-β-gal阳性率无明显影响。由此提示，灵芝多糖对衰老的改善作用可能是通过p53信号转导途径实现的。

Fig.4 Effect of GLP on senescence associated β-galactosidase(SA-β-gal)staining of wild type zebrafish embryos.See Tab.1 for the treatment.A:images detected by a microscope(×2)；B:the quantitative result of A.A1:control group；A2，A3 and A4:GLP 1，2 and 3 g·L－1，respectively.，n＝3.∗P＜0.05，compared with control(0)group.

Fig.5 Effect of GLP on SA-β-gal staining of p53-knockout zebrafish embryos.See Tab.1 for the treatment. A:images detected by a microscope(×2).B was the quantitative result of A.1:wild type control group；2:p53-knockout control group；3，4 and 5:p53-knockout zebrafish embryos treated with GLP 1，2 and 3 g·L－1，respectively.，n＝3.

2.4 灵芝多糖对野生型和p53基因敲除斑马鱼衰老相关基因表达的影响

由图6结果表明，与对照组比较，GLP 2 g·L－1可以显著降低野生型斑马鱼胚胎细胞p53和p21基因表达(P＜0.01，P＜0.05)，TERT和mdm2基因表达无明显变化。灵芝多糖1，2和3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼胚胎细胞上述基因的表达无明显影响(图7)。进一步提示灵芝多糖的抗衰老作用部分是通过p53信号转导途径实现的。

Fig.6 Effect of GLP on expression of p53，p21，murine double minute 2(mdm2)and telomerase reverse transcriptase(TERT)genes in wild type zebrafish embryos.See Tab.1 for the treatment.A:images detected by a microscope；B:the semi-quantitative result of A.IA: integrated absorbance.Lane 1:control group；lane 2，3 and 4: GLP 1，2 and 3 g·L－1，respectively.，n＝3.∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，compared with control group.

Fig.7 Effect of GLP on expression of p53，p21，mdm2 and TERT genes in p53-knockout zebrafish embryos.See Tab.1 for the treatment.A:images detected by a microscope.B:the semi-quantative result of A.1:wild type control group；2:p53-knockout control group；3，4 and 5:p53-knockout zebrafish embryos treated with GLP 1，2 and 3 g·L－1，respectively.，n＝3.

3 讨论

高等生物基本都是由单细胞(受精卵)发育而来，很多学者认为生命在胚胎期对外源化学物质最为敏感[9]，所以对其研究具有很好的监测意义。由于斑马鱼体外受精，体外发育且胚体透明，可在显微镜下直接观察其生长发育情况。p53基因除了作为肿瘤抑制基因外，还有多种重要的功能，包括细胞凋亡和细胞衰老等等。所以本研究选取对照和不同浓度灵芝多糖处理的野生型及p53基因敲除型斑马鱼胚胎进行可见光下拍照，可以更直观地看到不同处理对斑马鱼生长发育的影响。本研究结果表明，对于野生型斑马鱼，灵芝多糖1和2 g·L－1对斑马鱼胚胎存活和畸形无影响，灵芝多糖3 g·L－1时野生型斑马鱼死亡率明显升高，同时导致斑马鱼发育异常，主要表现为头部发育异常及躯体弯曲。灵芝多糖1，2和3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼胚胎细胞的存活和畸形无明显影响。这可能是p53基因敲除后，导致由p53基因介导的代谢调控网络发生变化，从而使细胞丧失了面对应激状态下的调控所致。

SA-β-gal阳性率能较好地反映细胞群体或个体组织的老化速度，是反映衰老程度的重要生物学指标，被广泛应用[10－11]。本研究结果表明，灵芝多糖2 g·L－1组野生型斑马鱼胚胎细胞SA-β-gal染色阳性率与对照相比明显降低，灵芝多糖1，2和3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼胚胎细胞SA-β-gal阳性染色率则无明显影响。由此提示，灵芝多糖可以延缓野生型斑马鱼衰胚胎细胞衰老进程，灵芝多糖对衰老的干预作用可能是通过p53信号转导途径实现的。

斑马鱼p53基因由11个外显子和10个内含子组成，外显子1和外显子11部分序列不参与编码蛋白质。在受到DNA损伤、缺氧和辐射等应激信号时，p53会发挥其转录激活功能，调控一系列靶基因的转录表达，进而引起DNA损伤修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡等应激反应[12－13]。所以其主要的生物学作用是调控细胞周期和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长。p21在转录水平上由p53活化，主要介导端粒依赖和各种应急条件如DNA损伤等引起的衰老[14－16]，mdm2是目前己知的细胞内最重要p53负性调控因子，mdm2含有一个p53基因结合位点，与p53结合形成复合物，抑制p53的转录活性。mdm2表达过强则可封闭p53介导的反式激活作用，使p53功能丧失，导致基因的不稳定和细胞增生。DNA损伤时，导致mdm2失活和p53水平升高[17]。本研究结果表明，灵芝多糖2 g·L－1处理后，野生型斑马鱼胚胎细胞p53和p21基因(p53直接靶点)表达明显降低。灵芝多糖1，2和3 g·L－1对p53基因敲除斑马鱼胚胎细胞上述基因的表达无明显影响，这些结果进一步表明，灵芝多糖抗衰老的部分作用机制可能是通过p53信号转导途径实现的。

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Effect of ganoderma polysaccharide on survival，development and senescence of zebrafish

XIA Guang-qing1，YAO Hui-min2，DONG Li-hong3，LIU Wei1
(1.School of Life Sciences，2.College of Pharmaceutical and Food Science，3.School of Chemistry，Tonghua Normal University，Tonghua134002，China)

OBJECTlVE To study the effect of ganoderma polysaccharide(GLP)on zebrafish (Danio rerio)survival，development and senescence.METHODS A p53-knockout zebrafish model was established by injecting of morpholino phosphorodiamidate(MO)into normal zebrafish eggs in the single cell development stage.Different concentrations of GLP 1，2 and 3 g·L－1were used to treat both wild type and p53-knockout zebrafish embryos 8 h post fertilization(8 hpf)under 28℃ for 3 d.The survival and malformation rates were calculated after 72 hpf，and the effect of GLP on cell senescence was evaluated by senescence associated β-galactosidase(SA-β-gal)staining both in wild type and p53-knockout zebrafish embryos.In addition，the differential gene expression of cancer inhibitor gene(p53)，telomerase reverse transcriptase(TERT)，murine double minute2(mdm2)and p21 was examined by RT-PCR both in wild type and p53-knockout zebrafish embryos after treatment with different concentrations of GLP.RESULTS GLP 1 and 2 g·L－1had no effect on development of wild type zebrafish embryos，but after GLP 3 g·L－1treatment，most of zebrafish embryos displayed malformation and the survival rate was only 48.6%.GLP 1，2 and 3 g·L－1had no effect on survival and development of p53-knockout zebrafish embryos.After GLP 2 g·L－1treatment for 3 d，the SA-β-gal staining positive rate of wild type zebrafish embryos was reduced compared with control group(P＜0.01)，while there was no significant change in p53-knockout zebrafish embryos.The results of RT-PCR showed that GLP 2 g·L－1treatment depressed p21 and p53 gene expression(P＜0.05，P＜0.01)，and had no effect on mdm2 and TERT gene expression of wild type zebrafish embryos.For p53-knockout zebrafish embryos，the TERT，mdm2，p21 and p53 gene expression displayed no significant difference after GLP 2 g·L－1treatment.CONCLUSlON GLP 2 g·L－1may improve senescence of wild type zebrafish embryo cells.GLP≥3 g·L－1may lead to death and abnormal development of wild type zebrafish embryos.The improvement of GLP on senescence of wild type zebrafish embryo cells might be mediated by its down-regulation of p21 and p53 gene expression.

ganoderma polysaccharide；zebrafish；senescence

LIU Wei，E-mail:lwtong＠163.com，Tel:13614351127

R285.5，R977.9

A

1000-3002(2014)04-0491-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.003

Foundation item:The project supported by Natural Science Foundation of Jilin Province(201215227)

2013-12-21 接受日期:2014-06-26)

(本文编辑:齐春会)

吉林省自然科学基金(201215227)

夏广清 (1972－)，女，博士，教授，主要从事中药药理学研究。E-mail:qingguangx＠163.com，Tel: 13843517281

刘 伟，E-mail:lwtong＠163.com，Tel: 13614351127