罗格列酮对顺铂所致肾损伤大鼠肾功能的改善作用及其抗氧化应激作用机制

张 玲，樊 华

(1.天津医科大学第二医院药剂科，天津 300210；2.天津市南开医院药剂科，天津 300100)

罗格列酮对顺铂所致肾损伤大鼠肾功能的改善作用及其抗氧化应激作用机制

张 玲1，樊 华2

(1.天津医科大学第二医院药剂科，天津 300210；2.天津市南开医院药剂科，天津 300100)

目的 探讨罗格列酮(ROM)对顺铂(DDP)所致肾损伤大鼠肾功能的改善作用及其抗氧化应激作用机制。方法 体外实验:DDP 0.4～100 μmol·L－1与人HEK293细胞单独作用48 h,或者提前2 h加入ROM 0.01～1000 μmol·L－1再与DDP 25 μmol·L－1联合作用48 h,用MTT法测定细胞存活率；提前2 h加入ROM 100 μmol·L－1再与DDP 25 μmol·L－1联合作用48 h,用比色法测定细胞培养液中丙二醛(MDA)浓度和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性。体内实验:将60只大鼠随机分为正常对照、模型(DDP 5 mg·kg－1)、模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1组,DDP 5 mg·kg－1尾静脉注射,每周1次,连续3周,制备DDP肾损伤大鼠模型；在第1次注射DDP后,模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1组ig给予ROM,每天1次,连续8周。8周后腹主动脉取血,用生化分析仪检测大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,用比色法检测肾组织一氧化氮(NO)和MDA含量及一氧化氮合酶(NOS)、GSH和超氧化物歧化酶(SOD)活性,同时取肾组织用HE染色观察肾组织病理改变。结果 体外实验:DDP单独作用48 h抑制 HEK293细胞存活的IC50值为21.0 μmol·L－1；提前2 h加入ROM 1～1000 μmol·L－1再与 DDP 25 μmol·L－1继续共孵育48 h,与DDP 25 μmol·L－1单用组比较,HEK293细胞存活率明显升高(P＜0.05,P＜0.01)；DDP 25 μmol·L－1与ROM 100 μmol·L－1联合作用48 h,细胞培养液中MDA含量与DDP 25 μmol·L－1单用组比较明显降低(P＜0.01), GSH活性明显升高(P＜0.01)。体内实验:与正常对照组相比,模型组血清BUN和Cr含量明显升高(P＜0.01),肾组织MDA含量升高(P＜0.01),GSH和SOD活性降低(P＜0.01),NO含量和NOS活性亦明显降低(P＜0.05)。与模型组比较,模型＋ROM 5,10和20 mg·kg－1组血清BUN从(17.0±1.3)mmol·L－1降低至14.0±4.1,11.2±1.8和(6.1±1.0)mmol·L－1(P＜0.01)；模型＋ROM 10和20 mg·kg－1组血清Cr含量从(124.6±39.8)mmol·L－1降低至49.0±5.2和(47.1±2.9)mmol·L－1(P＜0.01),肾组织GSH和SOD活性升高(P＜0.05,P＜0.01),MDA含量降低(P＜0.05,P＜0.01),NO含量和NOS活性亦明显升高(P＜0.05,P＜0.01),肾组织病理损伤减轻。结论 ROM对DDP所致肾损伤大鼠肾功能具有保护作用,其作用机制可能与其抗氧化应激作用有关。

罗格列酮；顺铂；肾损伤；氧化应激

顺铂(cisplatin，DDP)为治疗多种实体瘤的一线用药，是当前化疗中最常用的药物之一，具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用且无交叉耐药等特点。但是DDP作为一种细胞毒性药物，其在治疗肿瘤的同时引起肾毒性，影响患者的生活质量。大剂量或连续给药时，可使肾小管损伤表现为不可逆性，严重者可导致肾衰竭甚至死亡[1－3]。目前，DDP所致肾毒性的机制尚不十分清楚。研究表明，DDP在机体中破坏氧自由基代谢的平衡状态从而引发氧化应激[4－5]。近来研究发现，罗格列酮(rosiglitazone，ROM)可以降低高糖环境对肾的氧化应激损伤，对肾氧化应激损伤有一定的保护作用[6－7]，本研究采用DDP制备大鼠肾损伤模型，探讨ROM对DDP所致肾氧化应激损伤是否有保护作用，从而为临床DDP所致氧化应激的辅助治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

雄性SD大鼠，体质量200～240 g，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号: SCXX(京)2007-0001。ROM，济南中科一通化工有限公司，批号:101N852，生理盐水溶解备用；DDP针剂，济南齐鲁制药有限公司，批号1020032DB。MTT，美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基和胰酶，美国Gibco公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。全自动血液生化分析仪，日本Hitachi公司。

1.2 细胞培养

人胚肾细胞HEK293细胞，上海生命科学研究院细胞库；培养基为含双抗及10%新生牛血清的DMEM(含丙酮酸钠)，于37℃，5%CO2培养箱中培养，取处于指数生长期的细胞用于实验。

1.3 MTT法测定细胞存活率[8]

将HEK293细胞接种于96孔板中，每孔4.0×103细胞，24 h后分别加入不同浓度的DDP，使其终浓度分别为0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50和100 μmol·L－1，每个浓度设3复孔，孵育48 h后后加入MTT 0.5 g·L－1，每孔20 μL，于37℃下共孵育4 h，吸除培养液后加入等体积的DMSO，室温振荡10 min，490 nm测定其吸光度(A490nm)值。

将HEK293细胞接种于96孔板中，每孔5×103细胞，分为溶剂对照组、DDP 25 μmol·L－1组和DDP＋ROM 0.01，0.1，1，10，100和1000 μmol·L－1组，每组均设6复孔，培养24 h后，DDP＋ROM组加入不同浓度的ROM，2 h后加入DDP 25 μmol·L－1，孵育48 h后同上检测细胞存活率。细胞存活率(%)＝实验组A490nm/对照组A490nm×100%。

1.4 细胞内MDA含量和GSH活性测定

将HEK293细胞3 mL接种到6孔板中，接种密度为3×107L－1，分成正常对照、DDP、ROM和DDP＋ROM组，24 h后ROM和DDP＋ROM组加入ROM，终浓度为100 μmol·L－1，2 h后DDP和DDP＋ROM组加入终浓度为25 μmol·L－1的DDP，48 h后消化并收集细胞，PBS洗2次，1680×g离心15 min，弃上清液，PBS清洗，反复冻融3次，1680×g离心15 min，取上清液为细胞匀浆，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[9]，按照试剂盒说明书测定MDA含量和GSH活性。

1.5 酶标法测定大鼠血清BUN和Cr含量、肾组织NO和MDA含量及NOS，SOD和GSH酶活性

将60只SD鼠随机分为正常对照、模型(DDP 5 mg·kg－1)、模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1组，每组12只。除正常对照组外，其余各组尾静脉注射DDP 5 mg·kg－1，每周1次，连续3周，制备DDP肾毒性模型。正常对照组给予等量生理盐水，模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1组在第1次注射DDP后ig给予相应剂量的ROM，正常对照组和模型组给予相应体积的生理盐水，连续给药8周，末次给药24 h后将大鼠麻醉后在无菌条件下腹主动脉取血，制备血清，全自动生化分析仪检测BUN和Cr含量。取出1 g肾组织加入9 mL生理盐水于玻璃匀浆管中制成10%组织匀浆，匀浆后于4℃12 000×g离心20 min，取上清，考马斯亮蓝法测定肾组织蛋白含量[9]，严格按照试剂盒说明测定MDA水平、SOD和GSH的活性、NO含量和NOS活性。

1.6 HE染色观察肾组织病理变化

肾组织用体积分数为0.04甲醛固定48 h，脱水后石蜡包埋，制片，HE染色，在光镜下检查。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 DDP对HEK293细胞存活率的影响

由图1可知，DDP体外对HEK293存活具有抑制作用，随DDP浓度的升高，细胞存活率下降，IC50值为20.1 μmol·L－1。

Fig.1 Effect of cisplatin(DDP)on cell survival of human HEK293 cells in vitro.HEK293 Cells were cultured with DDP 0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50 and 100 μmol·L－1for 48 h，and MTT assay was used to detect survival cells.Survival rate(%)＝A490nmof DDP group/A490nmof control group×100%.，n＝3.

2.2 ROM对DDP损伤HEK293细胞存活率的影响

由表1可知，DDP 25 μmol·L－1与HEK293细胞单独孵育48 h，细胞存活率为(27.6±3.2)%；ROM 1～100 μmol·L－1预孵育 2 h可显著提高HEK293细胞存活率(P＜0.05，P＜0.01)，表明ROM可减轻DDP对HEK293细胞的毒性作用。

Tab.1 Effect of rosiglitazone(ROM)on survival rate of HEK293 cells damaged by DDP in vitro

2.3 ROM对DDP损伤HEK293细胞MDA和GSH的影响

由表2可知，与正常对照组相比，ROM组MDA含量和GSH活性无明显变化；DDP组细胞内MDA含量升高(P＜0.01)，GSH活性降低(P＜0.05)。与DDP组相比，DDP＋ROM组MDA含量显著降低(P＜0.01)，GSH活性升高(P＜0.01)，其中GSH活性接近正常对照组水平。

Tab.2 Effect of ROM on malondialdehyde(MDA)and glutathione peroxidase(GSH)in HEK293 cells damaged by DDP in vitro

2.4 ROM对DDP损伤大鼠血清BUN和Cr水平的影响

如表3所示，与正常对照组相比，模型组血清BUN和Cr含量明显升高(P＜0.01)；模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1组血清BUN和Cr含量与模型相比明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1组接近正常对照组水平。

Tab.3 Effect of ROM on serum level of blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)of rats damaged by DDP

2.5 ROM对DDP损伤大鼠肾组织MDA水平、GSH和SOD活性的影响

如表4所示，与正常对照组相比，模型组MDA水平明显升高(P＜0.01)，GSH和SOD活性明显降低(P＜0.01)；模型＋ROM 10和 20 mg·kg－1组MDA含量与模型组相比明显降低(P＜0.05)，SOD和GSH活性明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1接近正常对照组水平。

Tab.4 Effect of ROM on MDA level and activities of superoxide dismutase(SOD)and GSH in renal tissue of rats damaged by DDP

2.6 ROM对DDP损伤大鼠肾组织NO含量和NOS活性的影响

如表5所示，与正常对照组相比，模型组NO水平明显降低(P＜0.01)，NOS活性也明显下降(P＜0.05)；模型＋ROM 5，10和20 mg·kg－1组与模型组相比NO含量和NOS活性显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，其中模型＋ROM 20 mg·kg－1组接近正常对照组水平。

Tab.5 Effect of ROM on nitric oxide(NO)level and nitric oxide synthase(NOS)activity in renal tissue of rats damaged by DDP

2.7 ROM对DDP损伤大鼠肾组织病理变化的影响

Fig.2 Effect of ROM on histopathological changes in renal tissue of rats damaged by DDP(HE，×100).A: normal control；B:model group，the arrows indicated diffuse renal tubular degeneration，and inflammatory cell infiltration；C:model＋ROM 5 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration；D:model＋ROM 10 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration；E:model＋ROM 20 mg·kg－1，the arrow indicated interstitial inflammatory infiltration.

由图2结果表明，正常对照组大鼠肾小球、肾小管结构清晰，形态正常，无明显病理变化(图2A)。模型组大鼠肾小管弥漫性肾小管浊肿变性，部分管腔扩张，炎性细胞浸润，上皮细胞空泡变性(图2B)。与模型组比较，模型＋ROM 5 mg·kg－1组病理变化减轻不明显，模型＋ROM 10和20 mg·kg－1组病理变化减轻，表现为轻度炎性浸润(图2C，D，E)。

3 讨论

DDP是一种广泛应用的抗癌药物，与氧化应激有关的氧化损伤可能是DDP肾毒性的主要原因。DDP的肾毒性一方面是氧自由基的大量产生，另一方面是抗氧化剂防护作用的缺失，DDP可诱发机体抗氧化水平降低，导致机体对抗癌药物产生的自由基引起的防护作用减弱。一些天然产物及合成的抗氧化剂能明显拮抗DDP的肾毒性。近年来研究显示，ROM在糖尿病肾病中具有肾保护作用，可以降低高糖环境下引起的肾组织活性氧增多，增强机体抗氧化酶活性，提高清除自由基的能力[7]。但对ROM在药物性肾氧化应激损伤方面的研究报道较少。

本研究通过体外实验发现，DDP对HEK293细胞有损伤作用。随后用递增浓度的 ROM与HEK293细胞预孵育2 h，结果表明，ROM可明显降低DDP对HEK293细胞的损伤，当ROM在100 μmol·L－1时 HEK293细胞存活率为(72.3± 9.7)%，明显高于DDP 25 μmol·L－1与HEK293细胞单独孵育时的细胞存活率(27.6±3.2)%。而且发现，在此浓度下，ROM可有效拮抗DDP导致的MDA浓度升高以及GSH活性的降低。由此推测，ROM对DDP造成的细胞损伤具有保护作用，可能是通过提高抗氧化应激作用实现的。

为了进一步验证体外实验的结果，本研究采用DDP制备肾损伤模型。据报道，肾损伤时肾排出Cr和BUN的能力下降[10]，引起血清中Cr和BUN含量升高，因此血清中Cr和BUN的含量是评价肾功能的主要指标。本研究结果表明，DDP 5 mg·kg－1组Cr和BUN含量明显增高，表明DDP对大鼠肾功能造成损伤；DDP 5 mg·kg－1＋ROM 5，10和20 mg·kg－1组血清中Cr和BUN的含量与DDP 5 mg·kg－1组相比均明显下降，表明ROM可以改善DDP对肾造成的损伤。

MDA是脂质过氧化的产物，MDA含量可以反映脂质过氧化程度。SOD和GSH是机体主要的抗氧化酶[11－12]，SOD和GSH水平是反映机体抗氧化能力的重要指标。本研究结果表明，与 DDP5 mg·kg－1组相比，DDP＋ROM 10和20 mg·kg－1能显著降低MDA含量，提高SOD和GSH活性，表明ROM可提高DDP肾损伤大鼠的氧化应激作用。肾组织病理学检查同样证实，给予ROM 8周，可明显改善DDP引起的肾组织嗜碱性变以及炎性浸润。

NO和NOS也是机体抗氧化能力的重要指标[13]，NO在肾血管内皮细胞通过NOS合成。本研究结果表明，与正常对照组比较，DDP 5 mg·kg－1组NO含量降低，NOS活性降低，提示DDP对血管内皮细胞的NOS活性有损伤作用，使NO含量下降，从而降低肾抗氧化能力。经过ROM干预后，NOS活性增加，NO含量升高，进一步提示ROM对DDP导致的肾氧化损伤具有改善作用。

综上所述，ROM对DDP造成的大鼠肾损伤具有保护作用，其作用机制可能通过降低肾组织MDA含量、增加GSH含量和SOD活性以及增加NO含量和NOS活性，从而提高机体组织抗氧化能力。

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R965，R977

A

1000-3002(2014)04-0525-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.009

张 玲(1979－)，女，药师，主要从事心血管药理学研究。

樊 华，Tel:(022)27435025，E-mail: songyu＠bankofshanghai.com