牵拉对毒蕈碱受体和5-羟色胺受体介导大鼠离体胃平滑肌收缩功能的影响

王东凯，任雪姣，卢丹丹，任雷鸣

(1.河北医科大学中西医结合学院，河北石家庄 050017；2.河北医科大学第四医院，河北石家庄 050011)

牵拉对毒蕈碱受体和5-羟色胺受体介导大鼠离体胃平滑肌收缩功能的影响

王东凯1∗，任雪姣2∗，卢丹丹1，任雷鸣1

(1.河北医科大学中西医结合学院，河北石家庄 050017；2.河北医科大学第四医院，河北石家庄 050011)

目的 研究牵拉对毒蕈碱(M)受体及5-羟色胺(5-HT)受体介导大鼠离体胃平滑肌收缩功能的影响。方法 大鼠离体胃底、胃体、胃窦、贲门和幽门环行肌标本分别给予1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 g的前负荷,除胃窦环肌给予单浓度卡巴胆碱(CCh)(0.3 μmol·L－1)外,其余标本采用累积给药法给予CCh 0.001～30 μmol·L－1,5-HT 0.0001～30 μmol·L－1,记录收缩反应。结果 大鼠胃底、胃体和幽门环肌在1.0 g前负荷下,CCh诱发收缩反应的－Log EC50值最大,－Log EC50值随前负荷升高而显著减小(P＜0.05,P＜0.01)；5-HT诱发胃底环行肌收缩反应结果类似。与1.0 g前负荷相比,3.0 g前负荷时CCh和5-HT诱发贲门环肌收缩反应的 Emax值分别增大117.4%和75.7%；5-HT诱发胃体环肌收缩反应的 Emax值亦增大115.9%。CCh诱发各环行肌收缩的Emax值(g)分别为:贲门10.453±2.956(3.0 g前负荷)、胃底13.878± 2.618(2.5 g前负荷)、胃体10.244±1.843(2.5 g前负荷)、幽门2.585±1.098(2.5 g前负荷)。5-HT诱发各环肌收缩的Emax值(g)分别为:贲门4.363±1.705(3.0 g前负荷)、胃底3.931±0.615(3.0 g前负荷)、胃体3.161±0.680(3.0 g前负荷)。结论 0.5 g或1.0 g前负荷不适于研究M受体和5-HT受体介导的大鼠离体贲门、胃底、胃体和幽门环肌的收缩反应,2.0 g前负荷可能是研究M受体和5-HT受体介导大鼠离体胃环肌收缩反应的理想条件。

受体,毒蕈碱；受体,5-羟色胺；牵拉；胃体；胃底；贲门；幽门

胃平滑肌条是医学研究中的常用实验标本，受体激动剂诱发收缩反应的半数有效量(EC50)和最大反应(Emax)是2个关键参数。国内文献报道，大鼠离体胃平滑肌条常施予1.0 g前负荷[1－3]；国外文献中，前负荷差异较大，0.5 g[4]，1.0 g[5－8]和2.0 g[9－10]均有报道，但未注明前负荷选择的理由。国外曾有报道，不同前负荷能影响人支气管平滑肌[11]和犬冠状动脉平滑肌[12]标本的收缩效能；Ren等[13]报道，在兔离体血管环肌标本，不同程度牵拉对α1受体介导收缩的EC50值有显著影响，推测不同前负荷对不同受体介导平滑肌收缩的影响不同。

哺乳动物大约95%的5-羟色胺(5-hydroxy-tryptamine，5-HT)存在于胃肠道[14]；5-HT1A和5-HT1D受体激动剂可调节胃动力。舒马曲坦激活5-HT1B/1D受体，对功能性消化不良患者可松弛胃底(延迟胃排空)，改善胃的顺应性，减轻胃胀和早饱感[15]。乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)是副交感神经的递质，能激动各类胆碱受体，兴奋胃肠平滑肌。

本研究以卡巴胆碱(carbachol，CCh)和5-HT作为胃平滑肌收缩剂，分析不同牵拉程度对M受体和5-HT受体介导收缩的影响，各激动剂产生收缩时药物EC50值和Emax值的变化规律。

1 材料与方法

1.1 药品、实验动物和仪器

CCh购自德国ABCR GmbH＆Co KG公司，5-HT购自日本Kasei Kogyo Co Ltd公司。K-H液成分(mmol·L－1):NaCl 133、KCl 4.7、MgSO40.61、NaH2PO41.35、CaCl22.52、NaHCO316.3、葡萄糖7.8，pH 7.2，均购自美国Sigma公司。30只健康雄性Wistar大鼠，体质量 250～300 g，许可证号SCXK(冀)2013-1-003，由河北省实验动物中心提供。PowerLab 8/35型数据采集系统(包括Octal Bridge Amp、张力换能器)由澳大利亚AD Instruments Pty Ltd生产；CP213型电子天平是美国Ohaus Corporation公司产品。

1.2 离体胃平滑肌标本的制备

大鼠禁食不禁水12 h，乌拉坦1.5 g·kg－1皮下注射麻醉后颈动脉放血处死，取全胃。沿胃大弯剪开，以95%O2＋5%CO2、4℃改良K-H液中漂洗干净，沿环肌方向切取腹侧胃底、胃体、胃窦、贲门和幽门环肌5个部位[16－17]。每只大鼠取胃底环肌2条、胃体环肌2条以及胃窦、贲门和幽门环肌各1条，分别长约2 mm×8 mm，去除黏膜。标本一端固定于支架上，另一端接张力换能器，置于(37±0.5)℃的K-H液浴槽中。

胃底、胃体、胃窦、贲门和幽门环肌分别给予1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g的前负荷。在各自前负荷下平衡1 h(每15 min换1次K-H液)后开始实验。胃底、胃体、贲门和幽门环肌采用累积给药法给予CCh(0.001～30 μmol·L－1)；5种标本均累积给予 5-HT(0.0001～30 μmol·L－1)。预实验显示，＜0.3 μmol·L－1时，胃窦环肌的节律性收缩与强直性收缩区分不明显，难以分析数据；＞0.3 μmol·L－1时，收缩的节律紊乱。故胃窦环肌采用单浓度(0.3 μmol·L－1)给药法[18]。每个标本依次在5个前负荷下完成一种药物的5次量效曲线，张力换能器记录收缩反应(g)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 牵拉对CCh诱发胃平滑肌收缩的影响

CCh 0.001～30 μmol·L－1可使大鼠离体贲门、胃底、胃体和幽门环肌产生浓度依赖性收缩反应。双因素方差分析显示，贲门、胃底和胃体环肌在1.5，2.0，2.5和3.0 g前负荷下，CCh诱发的收缩显著大于1.0 g的收缩(P＜0.05，P＜0.01；图1A～C)。但是幽门环肌在1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g前负荷下，CCh诱发的收缩无统计学差异(图1D)。图2结果显示，单浓度给予CCh 0.3 μmol·L－1时，胃窦环肌在1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g前负荷下，CCh诱发的胃窦环肌强直性收缩的振幅随前负荷增加而下降，但无统计学差异(图2A)。CCh诱发的胃窦节律性收缩振幅随前负荷的增加而增强，前负荷2.0 g时收缩振幅显著强于1.0 g(P＜0.01，图2B)；前负荷2.5 g和3.0 g时收缩振幅与2.0 g相似(图2B)。胃窦环肌收缩频率与前负荷(1.0 g～3.0 g)呈明显的负相关(图2C)，由1.0 g时的5.5 min－1降至3.0 g时的1.4 min－1(P＜0.01)；胃窦环肌首先呈强直性收缩，继而为长时程节律性收缩(图2D)。

2.2 牵拉对5-HT诱发胃平滑肌收缩的影响

5-HT 0.0001～30 μmol·L－1可使大鼠离体贲门、胃底和胃体环肌产生浓度依赖性收缩。双因素方差分析显示，贲门、胃底和胃体环肌在2.0，2.5和3.0 g前负荷下，5-HT诱发的收缩显著大于1.0 g时收缩(P＜0.05，P＜0.01；图3A～C)。5-HT对胃窦和幽门环肌无明显作用(数据略，n＝8)。

Fig.1 Contractile responses to carbachol(0.001－30 μmol·L－1)in isolated circular muscle strips of rat gastric cardia(A，n＝9)，fundus(B，n＝20)，gastric body(C，n＝18)and pylorus(D，n＝10)under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g..∗P＜0.05，∗∗P＜0.01 compared with preload 1.0 g.

Fig.2 Responses to carbachol 0.3 μmol·L－1in isolated circular muscle strips of rat gastric antrum.A:stiffnass amplitude；B:rhythmamplitude；C:rhythm frequency.，n＝6.∗P＜0.05，∗∗P＜0.01 compared with preload 1.0 g.

Fig.3 Contractile responses to 5-hydroxytryptamine(5-HT，0.0001－30 μmol·L－1)in isolated circular muscle strips of the rat gastric cardia(A，n＝12)，fundus(B，n＝7)and gastric body(C，n＝7)under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g..∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，compared with preload 1.0 g.

2.3 牵拉对CCh和5-HT诱发最大收缩和EC50的影响

单因素方差分析显示(表1)，贲门、胃底和胃体环肌在1.0～3.0 g前负荷下，CCh诱发的最大收缩反应(Emax)随着牵拉强度增大而升高；幽门环肌则无显著改变。4种环肌的实测Emax值(CCh)分别为:贲门10.453±2.956(3.0 g)、胃底13.878±2.618 (2.5 g)、胃体10.244±1.843(2.5 g)和幽门2.585± 1.098(2.5 g)。贲门、胃底和胃体环肌对5-HT的反应类似于CCh，但是其Emax值明显小于CCh；3种标本的实测Emax值(5-HT)分别为:贲门4.363±1.705 (3.0 g)、胃底3.931±0.615(3.0 g)和胃体3.161± 0.680(3.0 g)。以2.5 g的Emax值作为对照进行统计学分析显示，2.0 g和3.0 g前负荷下CCh和5-HT的Emax值无显著差异。

单因素方差分析结果显示(表2)，在 1.0～3.0 g前负荷下，CCh和5-HT诱发贲门收缩的EC50值无显著改变，5-HT诱发胃体环肌收缩的EC50值亦无显著改变。在1.0 g前负荷下，CCh和5-HT诱发胃底环肌收缩的－Log EC50(mol·L－1)值分别为6.610±0.237和7.133±0.239；CCh诱发胃体和幽门环肌收缩的－Log EC50(mol·L－1)值分别为6.544±0.148和6.689±0.466。前负荷增至1.5，2.0，2.5和3.0 g时，各自的－Log EC50(mol·L－1)值逐渐变小(P＜0.05，P＜0.01)。以 2.5 g的－Log EC50值作为对照进行统计学分析结果显示，2.0 g和3.0 g前负荷下CCh和5-HT的－Log EC50值无显著差异。

Tab.1 Emaxof carbachol and 5-HT in various circular muscle strips of rats

Tab.2 －Log EC50of carbachol and 5-HT in various circular muscle strips of rats

3 讨论

本研究显示，0.5 g或1.0 g前负荷不适于研究M受体和5-HT受体介导的大鼠离体贲门、胃底、胃体和幽门环肌收缩。本课题组曾报道，在兔离体血管环标本，不同程度的牵拉(前负荷变化)对α1受体介导收缩的EC50和Emax产生显著影响[13]；本研究在大鼠离体胃组织中多个部位的环行肌条上，证实了不同牵拉程度对不同受体介导的平滑肌收缩的影响是不同的。

本研究发现，在1.0～3.0 g(含3.0 g)前负荷时CCh和5-HT诱发贲门环肌收缩、5-HT诱发胃体环肌收缩的EC50值均无改变。但是与1.0 g前负荷相比，3.0 g前负荷时CCh和5-HT诱发贲门肌收缩的Emax值分别增大117.4%和75.7%，5-HT诱发胃体肌收缩的Emax值亦增大115.9%。除胃窦外，与2.5和3.0 g时相比，其他4部位标本施以2.0 g前负荷时，其EC50值和Emax值均无统计学差异。但是，这4部位标本的前负荷低于2.0 g时，多数标本的Emax值显著降低。因此，推荐在2.0 g前负荷作用下，进行M受体和5-HT受体介导的大鼠离体胃平滑肌收缩的研究。鉴于这些标本在1.0 g和1.5 g前负荷下，药物诱发收缩反应的Emax值有较大变化并有统计学意义，因此，选择≤1.0 g的前负荷进行实验显然不合适。

M受体包含5种亚型，M1，M2和M3分布在胃肠道，M2和M3可介导大鼠胃平滑肌收缩，M3作用为主[19－20]。研究发现，大鼠胃底纵肌在1.0 g前负荷作用下，M2和 M3均可介导收缩，M3为主[21]。M2受体基因敲除小鼠的胃底和胃窦环肌在0.5 g前负荷下，CCh诱发收缩的EC50值明显大于野生型小鼠，而收缩的Emax值不变；对于M3受体基因敲除小鼠相同部位，CCh诱发收缩的Emax值降低约50%，EC50值则无明显改变；M2和M3受体基因同时敲除，CCh不再诱发收缩[22]。So等[23]报道，利用膜片钳技术和单细胞RT-PCR技术发现，豚鼠胃窦平滑肌表达M1～M5受体的mRNA，但能被乙酰胆碱激活的只有M2，M3和M4受体。本研究发现，大鼠离体贲门、胃底、胃体和幽门环肌在前负荷相同时(1.0 g，1.5 g或 2.0 g)，CCh诱发收缩的－Log EC50值(即 pD2值)均十分接近，提示上述4个部位胃组织中介导CCh诱发收缩的M受体可能相似。然而，在5-HT诱发大鼠贲门、胃底和胃体环肌收缩中，前负荷为1.0 g时的－Log EC50值依次为6.056±0.438，7.133±0.239和6.840±0.316，贲门与胃底环肌的－Log EC50的比值为11.9。前负荷增加至1.5 g，2.0 g或2.5 g时，贲门与胃底或胃体环肌相比，5-HT的－Log EC50值有明显差异；结果提示，介导贲门环肌收缩的5-HT受体亚型与胃底胃体不同。进一步确定大鼠贲门、胃底、胃体和幽门环肌中，介导CCh和5-HT收缩的受体亚型十分重要。

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Effect of stretch on muscarinic receptor-and 5-hydroxytryptamine receptor-mediated contractile responses in isolated gastric smooth muscle of rats

WANG Dong-kai1∗，REN Xue-Jiao2∗，LU Dan-dan1，REN Lei-ming1
(1.College of Chinese Integrative Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.the Fourth Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China)

OBJECTlVE To investigate the effect of stretch on muscarinic receptor-and 5-hydroxytryptamine(5-HT)receptor-mediated contractile responses in isolated circular muscle strips taken from the rat stomach.METHODS The contractile responses to carbachol(CCh)0.001－30 μmol·L－1or 5-HT 0.0001－30 μmol·L－1administered cumulatively were recorded in isolated circular muscle strips taken from the gastric fundus，body，cardia and pylorus of rats under different preloads of 1.0，1.5，2.0，2.5 and 3.0 g，but a single concentration of CCh 0.3 μmol·L－1was administered to the antrum. RESULTS The－Log EC50value for CCh in the isolated circular muscle strips of the gastric fundus，body and pylorus under 1.0 g preload was the largest，but decreased significantly with higher preloads (P＜0.05，P＜0.01).A similar result was obtained in the isolated circular muscle strips of the gastric body when 5-HT was used as an agonist.The Emaxvalue of contractile responses to CCh and 5-HT in the circular muscle strips of the gastric cardia under 3.0 g preload was increased by 117.4%and 75.7%compared to that under 1.0 g preload.The Emaxvalue of contractile responses to 5-HT in the circular muscle strips of the gastric body under 3.0 g preload was also increased by 115.9%when compared to 1.0 g preload.The Emax(g)value of contractile responses to CCh in four types of muscle strips was 10.453±2.956(cardia under 3.0 g preload)，13.878±2.618(fundus under 2.5 g preload)，10.244±1.843 (gastric body under 2.5 g preload)and 2.585±1.098(pylorus under 2.5 g preload)，respectively.The Emax(g)value of contractile responses to 5-HT in three types of muscle strips was 4.363±1.705(cardia under 3.0 g preload)，3.931±0.615(fundus under 3.0 g preload)and 3.161±0.680(gastric body under 3.0 g preload)，respectively.CONCLUSlON 0.5 g or 1.0 g preload is inadequate for accurate determination of contractile responses mediated by muscarinic receptors and 5-HT receptors in isolated circular muscle strips taken from the rat gastric cardia，fundus，body and pylorus，but 2.0 g preload is optimal for investigating muscarine receptor-or 5-HT receptor-mediated contractile responses of isolated gastric strips of rats.

receptors，muscarine；receptors，5-hydroxytryptamine；stretch；gastric body；fundus；cardia；pylorus

REN Lei-ming，E-mail:ren-leiming＠263.net，Tel:(0311)86266722

R975

A

1000-3002(2014)04-0519-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.008

Foundation item:The project supported by National Program on Key Basic Research Project of China(973 Program)(2012CB518601)；and National Science＆Technology Major Project of China(2011ZX 09102-011-04)

2014-01-09 接受日期:2014-07-14)

(本文编辑:乔 虹)

国家重点基础研究发展计划(973计划) (2012 CB518601)；国家科技重大专项(2011ZX09102-011-04)

王东凯(1984－)，男，硕士研究生；任雪姣(1985－)，女，硕士，主要从事肿瘤放射治疗学研究。

任雷鸣，Tel:(0311)86266722，E-mail: ren-leiming＠263.net

∗共同第一作者。