产植酸酶枯草芽孢杆菌ZX—29产芽孢条件的优化

王树香+李术娜+李红亚

摘要：试验研究了产植酸酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZX-29的芽孢产率及芽孢数量，采用单因素试验和正交试验对该菌产芽孢条件进行了优化。结果表明，该菌摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为：培养基成分：0.5%可溶性淀粉、2.0%蛋白胨、0.10% KH2PO4和0.05% MnSO4·H2O；培养条件：pH 8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL（250 mL三角瓶）。在此优化条件下，发酵液中该菌株的芽孢数量达到6.4×109个/mL，芽孢产率达到97.61%。

关键词：植酸酶；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZX-29；发酵；芽孢

中图分类号：TQ920.6；Q939.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0160-03

Optimization of Spore Production Conditions of Strain of Producing Phytase

Bacillus subtilis ZX-29

WANG Shu-xiang，LI Shu-na，LI Hong-ya

（College of Life Science， Hebei Agriculture University， Baoding 071001， Hebei，China）

Abstract： The sporulation rate and spore quantity of Strain of producing phytase B. subtilis ZX-29 were studied and the spore production process were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the optimal conditions of spore production were 0.5% Sorbitol， 2% Peptone， 0.1% KH2PO4 and 0.05% MnSO4·H2O， initial pH8.0， inoculating 20 h and filling 30 mL/250mL bottle the spore quantity of strain Bacillus subtilis ZX-29 achieves 6.4×109 per mL and the spore production rate achieved 97.61%.

Key words： phytase； Bacillus subtilis ZX-29； fermentation； spore

收稿日期：2013-06-19

基金项目：河北农业大学青年科学基金项目（QJ201233）

作者简介：王树香（1977-），女，河北唐山人，实验师，硕士，主要从事农业微生物、生物饲料和生物肥料方面的研究，（电话）15930281873

（电子信箱）wangshuxiang@hebau.edu.cn。

植酸酶（Phytase）在畜禽饲料生产中使用可解除植酸的抗营养作用，提高饲料中多种矿物元素和蛋白质、氨基酸的可利用性，又能提高植酸磷的利用率，降低粪便磷排泄造成的环境污染[1]。植酸酶对人体吸收营养物质具有明显的促进作用[2]。近年来植酸酶开始应用于植物性食品中，可达到分解植酸、平衡营养的作用[3]。

植酸酶是一类对热敏感的酶类，制粒过程中高温、高压及高含水量可对其产生极大破坏，导致目前商品植酸酶存在价格昂贵、产量低、不耐高温及产品质量不稳定等缺点[4]，因此获得高热稳定性的植酸酶是近年来植酸酶工业的研究热点和难点。在饲用植酸酶方面，筛选到能够直接产耐高温植酸酶的菌株是最佳方法。目前文献报道已分离到的产植酸酶的芽孢杆菌产酶普遍较低，达不到预期用于发酵生产的目的，因此增加芽孢杆菌植酸酶的产量成为目前亟待解决的研究课题之一[5，6]。目前已有关于芽孢杆菌植酸酶产酶条件优化的研究[7-11]，但仍不能达到预期可应用于发酵生产的效果[12]。

近年的研究已证明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZX-29具有安全、高效、耐热的特点。本试验通过单因素试验和多因素试验对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢条件进行研究，旨在为其工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 B. subtilis ZX-29，由河北农业大学制药工程实验室分离筛选。

1.1.2 培养基 本试验所用的培养基有牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基、发酵培养基等[13，14]。

1.1.3 测定方法 芽孢染色及生物量测定（血球计数板直接计数）均参照文献[15]。

1.1.4 试验方法 用单因素试验确定B. subtilis ZX-29产芽孢最佳的碳源、氮源及无机盐；按正交试验L16（44）确定最佳的培养基成分；L16（34）确定最佳的培养条件[13]。

2 结果与分析

2.1 碳源对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢的影响

从图1可看出，以可溶性淀粉作碳源时，B. subtilis ZX-29菌株芽孢和菌体的数量达到最高，芽孢产率为80.25%，说明可溶性淀粉作碳源有利菌体生长，因此最佳碳源选择可溶性淀粉为宜。

2.2 氮源对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢的影响

从图2可看出，培养48 h时，以蛋白胨为氮源的培养基中芽孢的产率最高，为98.15%，而且各种氮源的芽孢产率差异较大，因此，选择蛋白胨为B. subtilis ZX-29菌株产芽孢的最佳氮源。

2.3 无机盐对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢的影响

从图3可看出，不同的无机盐种类对芽孢形成的影响差异较大。B. subtilis ZX-29在培养72 h时，KH2PO4试验组中芽孢产率可达95.57%；铜盐组中则既没有菌体存在也无芽孢形成；MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢生成率也较高，可达到93.51%。试验结果显示KH2PO4为B. subtilis ZX-29菌株产芽孢的最佳无机盐。但由于用KH2PO4做无机盐时，虽然芽孢产率较高，但菌体的生长状况欠佳，而以MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢产率较高，菌体生长状况也较好，故B. subtilis ZX-29菌株培养基中的无机盐采用KH2PO4和MnSO4·H2O的复合盐为最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培养基成分优化正交试验结果

首先对B. subtilis ZX-29菌株不同培养时间进行芽孢计数，结果表明其发酵48 h时的芽孢产率达到90%以上，从而以发酵48 h的结果为代表进行正交分析。由表1可见，B. subtilis ZX-29菌株培养基最佳成分组成为：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培养条件优化正交试验结果

以B. subtilis ZX-29菌株发酵48 h的结果为代表进行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培养条件优化正交试验结果见表2。由表2可见，B. subtilis ZX-29菌株最优培养条件为：pH8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色结果

按以上优化条件对B. subtilis ZX-29菌株进行发酵培养，以血球计数板法测定其总生物量，并对所得芽孢进行孔雀绿染色和结晶紫染色观察。观察统计结果为：发酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢数量达到6.4×109个/mL，芽孢产率为97.61%。

3 小结与讨论

本试验通过比较B. subtilis ZX-29在不同条件下的芽孢产率，从而确定了该菌株摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为：培养基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培养条件：pH 8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL，培养温度30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵时间48 h。优化后的芽孢产率达到97.61%。最终生物量为6.4×109个/mL。河北农业大学制药工程实验室已经对一些拮抗菌、益生菌等的产芽孢条件的优化进行了多年研究，已达到了工业化生产的要求。并且通过多年研究可知，某些条件的刺激也有可能导致芽孢快速生成，比如突然降温、静置、添加固体介质等，但本研究中未进行相关试验，将在以后进行相关方面的研究，进一步完善试验结果，以便更快、更好地进行工业化生产。

参考文献：

[1] 吴华东，吴志青.植酸酶的特性及其在动物生产中的应用[J].江西畜牧兽医杂志，2011（5）：5-8.

[2] 王 陶，李 文，袁佩佩.中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质[J].食品科学，2012，33（1）：120-124.

[3] 李 文，王 陶.酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究[J].食品科学，2011，32（5）：228-233.

[4] 蒋治国.植酸酶的研究进展及其在饲料中的应用[J].黑龙江畜牧兽医，2010（8）：37-40.

[5] EDWARD J，MULIANEY H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，168（4）：35-36.

[6] 于 平 陈益润. 高产耐热型植酸酶菌株 ZJ0702 发酵条件优化[J].中国食品学报，2011，11（3）：98-103.

[7] 覃拥灵，何海燕. 产植酸酶菌种的选育及发酵条件初步研究[J].广西轻工业，2011（8）：14-16.

[8] 王亚茹，姚 斌，曾 虹.枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和酶学性质[J].微生物学报，2001，41（2）：198-203.

[9] 王文君，黄梅娜，夏延国，等.产中性植酸酶菌株的筛选及产酶条件的优化[J].中国酿造，2011（7）：89-93.

[10] 黄魁英，夏枫耿，黄乐天，等.耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化[J].现代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，杨红建，张晓明.瘤胃微生物植酸酶的分类与酶学性质研究进展[J].畜牧兽医学报，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陈益润.响应面法优化芽孢杆菌发酵生产植酸酶[J].中国粮油学报，2011，26（3）：86-90.

[13] 李术娜，王树香，王占利，等.大丽轮枝菌拮抗细菌B. subtilis LZ2-70产芽孢条件优化[J].棉花学报，2009，21（4）：307-312.

[14] 程丽娟，薛泉宏，来航线.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 无机盐对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢的影响

从图3可看出，不同的无机盐种类对芽孢形成的影响差异较大。B. subtilis ZX-29在培养72 h时，KH2PO4试验组中芽孢产率可达95.57%；铜盐组中则既没有菌体存在也无芽孢形成；MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢生成率也较高，可达到93.51%。试验结果显示KH2PO4为B. subtilis ZX-29菌株产芽孢的最佳无机盐。但由于用KH2PO4做无机盐时，虽然芽孢产率较高，但菌体的生长状况欠佳，而以MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢产率较高，菌体生长状况也较好，故B. subtilis ZX-29菌株培养基中的无机盐采用KH2PO4和MnSO4·H2O的复合盐为最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培养基成分优化正交试验结果

首先对B. subtilis ZX-29菌株不同培养时间进行芽孢计数，结果表明其发酵48 h时的芽孢产率达到90%以上，从而以发酵48 h的结果为代表进行正交分析。由表1可见，B. subtilis ZX-29菌株培养基最佳成分组成为：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培养条件优化正交试验结果

以B. subtilis ZX-29菌株发酵48 h的结果为代表进行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培养条件优化正交试验结果见表2。由表2可见，B. subtilis ZX-29菌株最优培养条件为：pH8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色结果

按以上优化条件对B. subtilis ZX-29菌株进行发酵培养，以血球计数板法测定其总生物量，并对所得芽孢进行孔雀绿染色和结晶紫染色观察。观察统计结果为：发酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢数量达到6.4×109个/mL，芽孢产率为97.61%。

3 小结与讨论

本试验通过比较B. subtilis ZX-29在不同条件下的芽孢产率，从而确定了该菌株摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为：培养基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培养条件：pH 8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL，培养温度30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵时间48 h。优化后的芽孢产率达到97.61%。最终生物量为6.4×109个/mL。河北农业大学制药工程实验室已经对一些拮抗菌、益生菌等的产芽孢条件的优化进行了多年研究，已达到了工业化生产的要求。并且通过多年研究可知，某些条件的刺激也有可能导致芽孢快速生成，比如突然降温、静置、添加固体介质等，但本研究中未进行相关试验，将在以后进行相关方面的研究，进一步完善试验结果，以便更快、更好地进行工业化生产。

参考文献：

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[2] 王 陶，李 文，袁佩佩.中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质[J].食品科学，2012，33（1）：120-124.

[3] 李 文，王 陶.酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究[J].食品科学，2011，32（5）：228-233.

[4] 蒋治国.植酸酶的研究进展及其在饲料中的应用[J].黑龙江畜牧兽医，2010（8）：37-40.

[5] EDWARD J，MULIANEY H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，168（4）：35-36.

[6] 于 平 陈益润. 高产耐热型植酸酶菌株 ZJ0702 发酵条件优化[J].中国食品学报，2011，11（3）：98-103.

[7] 覃拥灵，何海燕. 产植酸酶菌种的选育及发酵条件初步研究[J].广西轻工业，2011（8）：14-16.

[8] 王亚茹，姚 斌，曾 虹.枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和酶学性质[J].微生物学报，2001，41（2）：198-203.

[9] 王文君，黄梅娜，夏延国，等.产中性植酸酶菌株的筛选及产酶条件的优化[J].中国酿造，2011（7）：89-93.

[10] 黄魁英，夏枫耿，黄乐天，等.耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化[J].现代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，杨红建，张晓明.瘤胃微生物植酸酶的分类与酶学性质研究进展[J].畜牧兽医学报，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陈益润.响应面法优化芽孢杆菌发酵生产植酸酶[J].中国粮油学报，2011，26（3）：86-90.

[13] 李术娜，王树香，王占利，等.大丽轮枝菌拮抗细菌B. subtilis LZ2-70产芽孢条件优化[J].棉花学报，2009，21（4）：307-312.

[14] 程丽娟，薛泉宏，来航线.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 无机盐对B. subtilis ZX-29菌株发酵产芽孢的影响

从图3可看出，不同的无机盐种类对芽孢形成的影响差异较大。B. subtilis ZX-29在培养72 h时，KH2PO4试验组中芽孢产率可达95.57%；铜盐组中则既没有菌体存在也无芽孢形成；MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢生成率也较高，可达到93.51%。试验结果显示KH2PO4为B. subtilis ZX-29菌株产芽孢的最佳无机盐。但由于用KH2PO4做无机盐时，虽然芽孢产率较高，但菌体的生长状况欠佳，而以MnSO4·H2O作为无机盐时，其芽孢产率较高，菌体生长状况也较好，故B. subtilis ZX-29菌株培养基中的无机盐采用KH2PO4和MnSO4·H2O的复合盐为最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培养基成分优化正交试验结果

首先对B. subtilis ZX-29菌株不同培养时间进行芽孢计数，结果表明其发酵48 h时的芽孢产率达到90%以上，从而以发酵48 h的结果为代表进行正交分析。由表1可见，B. subtilis ZX-29菌株培养基最佳成分组成为：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培养条件优化正交试验结果

以B. subtilis ZX-29菌株发酵48 h的结果为代表进行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培养条件优化正交试验结果见表2。由表2可见，B. subtilis ZX-29菌株最优培养条件为：pH8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色结果

按以上优化条件对B. subtilis ZX-29菌株进行发酵培养，以血球计数板法测定其总生物量，并对所得芽孢进行孔雀绿染色和结晶紫染色观察。观察统计结果为：发酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢数量达到6.4×109个/mL，芽孢产率为97.61%。

3 小结与讨论

本试验通过比较B. subtilis ZX-29在不同条件下的芽孢产率，从而确定了该菌株摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为：培养基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培养条件：pH 8.0、种龄20 h、装瓶量30 mL，培养温度30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵时间48 h。优化后的芽孢产率达到97.61%。最终生物量为6.4×109个/mL。河北农业大学制药工程实验室已经对一些拮抗菌、益生菌等的产芽孢条件的优化进行了多年研究，已达到了工业化生产的要求。并且通过多年研究可知，某些条件的刺激也有可能导致芽孢快速生成，比如突然降温、静置、添加固体介质等，但本研究中未进行相关试验，将在以后进行相关方面的研究，进一步完善试验结果，以便更快、更好地进行工业化生产。

参考文献：

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[3] 李 文，王 陶.酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究[J].食品科学，2011，32（5）：228-233.

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[5] EDWARD J，MULIANEY H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，168（4）：35-36.

[6] 于 平 陈益润. 高产耐热型植酸酶菌株 ZJ0702 发酵条件优化[J].中国食品学报，2011，11（3）：98-103.

[7] 覃拥灵，何海燕. 产植酸酶菌种的选育及发酵条件初步研究[J].广西轻工业，2011（8）：14-16.

[8] 王亚茹，姚 斌，曾 虹.枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和酶学性质[J].微生物学报，2001，41（2）：198-203.

[9] 王文君，黄梅娜，夏延国，等.产中性植酸酶菌株的筛选及产酶条件的优化[J].中国酿造，2011（7）：89-93.

[10] 黄魁英，夏枫耿，黄乐天，等.耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化[J].现代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，杨红建，张晓明.瘤胃微生物植酸酶的分类与酶学性质研究进展[J].畜牧兽医学报，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陈益润.响应面法优化芽孢杆菌发酵生产植酸酶[J].中国粮油学报，2011，26（3）：86-90.

[13] 李术娜，王树香，王占利，等.大丽轮枝菌拮抗细菌B. subtilis LZ2-70产芽孢条件优化[J].棉花学报，2009，21（4）：307-312.

[14] 程丽娟，薛泉宏，来航线.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.