载脂蛋白E基因启动子-491 A/T、-427C/T多态性与血管性痴呆关系研究

季迁，刘芳，李敏

（1.沈阳医学院附属卫校，沈阳110034；2.沈阳医学院附属中心医院神经内科，沈阳110024）

载脂蛋白E基因启动子-491 A/T、-427C/T多态性与血管性痴呆关系研究

季迁1，刘芳2，李敏1

（1.沈阳医学院附属卫校，沈阳110034；2.沈阳医学院附属中心医院神经内科，沈阳110024）

Correlation Study between Apolipoprotein E Promoter-491 A/T，-427C/T Polymorphismsand Vascular Dementia

选择沈阳医学院附属中心医院神经内科血管性痴呆患者480例为实验组，从门诊体检健康老年人中收集480例为对照组。分别提纯患者外周血中基因组DNA，检测载脂蛋白E基因启动子多态性表达，探讨载脂蛋白E基因启动子多态性与血管性痴呆的关系。结果表明，载脂蛋白E基因启动子-491多态性位点基因型AA表达在实验组明显多于对照组（P＜0.05）。因此认为载脂蛋白E基因启动子-491多态性位点基因型AA表达与血管性痴呆疾病相关。

血管性痴呆；载脂蛋白E基因；启动子多态性

血管性痴呆（vascular denlentia，VD）是仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）的常见痴呆类型，随着我国人口的老龄化加剧，VD发病率逐年增加。VD由各种脑血管疾病导致，尽管临床上给予积极的治疗，但致残率仍很高。因此对VD发病机制与防治措施的研究具有极其重要的现实意义。目前流行病学的研究已表明载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）是血浆主要载脂蛋白之一，它参与机体脂质代谢，调节胆固醇平衡，同时参与神经系统的正常生长和损伤后的修复过程。APOE基因及其启动子的多态性在不同种族人群中分布不同，不同的多态性位点与VD的关联程度不同［1］。

本项目负责人在美期间首次证实北美人群APOE基因启动子多态性变化与血管性痴呆相关［2］。本实验应用病例对照研究，分析沈阳医学院附属中心医院神经内科480例VD患者APOE基因启动子多态性与VD之间的关系，为VD的早预测早治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2007年11月至2012年7月沈阳医学院附属中心医院神经内科住院的480例VD患者（VD组），病例入选条件以通用的NINDS-AIREN作为诊断标准［3］：（1）符合痴呆诊断：有记忆障碍以及至少有2个其他认知领域的障碍；（2）有脑血管病的证据，即CT或MRI影像学检查证据；（3）前2项必须有相关性，至少有以下的1项：①在明确的卒中后3个月内发生痴呆；②突然认识功能衰退，或波动性、阶梯样进行性认知功能损害。

从门诊体检健康老年人中收集480例作为对照组。VD组与对照组在性别、年龄、体重指数、高血压及糖尿病病史方面均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 VD组与对照组的一般资料比较

1.2 方法

从患者废弃血液标本的外周血白细胞中提取基因组DNA。患者签署知情同意书，实验符合医学伦理学标准。应用DNA聚合酶链反应（PCR）扩增技术进行APOE基因启动子区域扩增，其产物用DNA测序仪（美国Peabi公司，310型）测序。

PCR扩增APOE基因启动子，第1轮PCR引物序列：上游引物5′-CTC CAG AAT CCT AAC CTT AAC CCA GAA G-3′，下游引物5′-GTG GAG TCC TGC TAT GGC TTA CAT C-3′，PCR反应体系和扩增条件：用普通Taq酶，PCR反应体系25 μL，DNA模板1 μL，上游引物（20 μmol/L）：0.5 μL，下游引物（20 μmol/L）：0.5 μL，Taq聚合酶：0.125 μL，PCR buffer2.0 μL，dNTP：2.0 μL，双蒸水：18.375 μL。PCR反应条件：94.0℃预变性5 min，反应循环：变性94.0℃30 s，退火61.0℃30 s，延伸72℃1 min 30 s，循环30次，最后72℃延伸10 min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳，电压150 V，32 min。

第2轮PCR：上游引物5′-TCA AGC GAT TCT CCT GCC TCA G-3′，下游引物5′-AGT AAT ACA GAC ACC CTC CTC CAT TC-3′。PCR扩增条件：PCR反应的DNA模板为第1次PCR反应液稀释50倍后取2 μL，反应体系同前。反应条件：将72℃延伸1 min 30 s设定为1 min，选择60.3℃作为第2轮PCR的退火温度，产物进行测序分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0进行统计处理，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PCR产物纯化后测序结果显示：VD组患者APOE基因启动子-491多态性基因型AA 258例，AT 164例，TT 58例；对照组APOE基因启动子-491多态性基因型AA 214例，AT 174例，TT 92例。VD组基因型AA明显多于对照组，基因型AT及TT对照组明显多于VD组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。VD组APOE基因启动子-427 TT 176例，CT 168例，CC 136例；对照组APOE基因启动子-427基因型为TT 158例，CT 166例，CC 156例。2组APOE基因启动子-427多态性位点基因型分布均无统计学差异（P＞0.05）。见图1。

图1 单核苷酸序列分析

3 讨论

目前，对APOE基因多态性与VD关系的研究较少，结论几乎均为阴性。APOE基因多态性与AD有密切关系［4～7］。APOE主要存在于乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和部分高密度脂蛋白中，为多态性蛋白，有3个常见的异构体，即E2、E3和E4。各种APOE异构体的主要区别是氨基酸一级结构的不同，它涉及到半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）的交换：E3含1个Cys（第112位）；E4不含Cys，但比E3多1个Arg（第112位）；E2含2个Cys，但比E3少1个Arg（第158位）。这种单个氨基酸不同造成的异构体是由于APOE基因的多态性所决定的。已知APOE异构体是由3个等位基因编码，人群中有6种表型，即3种纯合子：E2/E2、E3/E3和E4/ E4，3种杂合子：E4/E3、E4/E2和E3/E2。在不同的人群中3个不同的APOE等位基因（Ε2、Ε3、Ε4）分布频率存在不同，因而决定了不同人群中APOE表型的频率差异。APOE基因启动子区域存在着多个多态性位点：-491A/T，-427C/T，-219 G/T，+113G/T等，由于其位置与基因编码区紧密关联，因而启动子多态性变化可改变APOE基因表达、表型分布及功能，从而影响APEO蛋白质表达。

VD的发生是个多因素的过程，可能是脑血管损伤、阿尔茨海默病样组织结构变化、白质疏松以及衰老等综合作用的结果［8］。APOE对神经系统有明显的影响，它参与神经系统的生理和病理过程，与神经系统的某些变性疾病、脑血管疾病、水肿性损伤等多种临床常见病有关［9］，其位点的多态性可能是大多数VD患者的危险因素。为更好地平衡可能的混杂因素，增强检验效率，提高可信性，本研究采用对照实验分析APOE基因的启动子多态性与VD的关联。结果显示：VD组APOE基因启动子-491多态性位点基因型AA明显多于对照组，基因型AT及TT对照组明显少于对照组（P＜0.05），由此推测APOE基因启动子-491位点的基因型AA表达差异与VD相关。可能是脑血管病后APOEmRNA表达上调，影响神经修复，加重神经组织损伤，从而导致VD。这与在北美人群APOE基因启动子-491多态性与VD密切相关的结论一致［10］。实验结果还显示VD组与对照组之间APOE基因启动子-427位点多态性分布差异无统计学意义（P＞0.05），但此结果不能完全确定-427位点多态性不是VD的危险因素，因APOE等位基因仅1/3为人类共有，其分布频率存在差异，与种族和地域因素有关。

综上所述，载脂蛋白E基因启动子-491位点基因型AA可能诱导血管性痴呆的发生。本地区人群APOE基因启动子区域其他多态性位点与VD的关系还有待进一步深入研究。

［1］Lambert JC，Mann D，Richard F，et al.Is there a relation between APOE expression and brain amyloid load in Alzheimer′s disease［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2005，76（7）：928-933.

［2］Liu，F，Sun X，Wang J，et al.Association between apolipoprotein E promoter-491T/G polymorphism and total cholesterol level in patients with Alzheimer disease［J］.Neural Regeneration Res，2006，9（1）：841-843.

［3］Nagata K，Saito H，Ucno T，et al.Clinical diagnosis of vascular dementia［J］.Semin Neurol，2007，257（1-2）：44-48.

［4］蔡海燕，杨东治，王朝霞.阿尔茨海默病与APOE基因多态性的关系探讨［J］.宁夏医学杂志，2013，35（12）：1149-1150.

［5］李光荣，赵明祥.载脂蛋白E基因启动子-307～-7区单核苷酸多态性与散发性阿尔茨海默病的相关研究［J］.临床与实验医学杂志，2010，9（10）：721-722.

［6］江文宇，吕泽平，覃莲，等.载脂蛋白E基因多态性与Alzheimer病和血管性痴呆的关系［J］.临床神经病学杂志，2010，23（6）：408-410.

［7］刘芳，付希久，吴冬，等.胆固醇及载脂蛋白E基因启动子多态性与血管性痴呆［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，16（11）：3058-3060.

［8］谢宁，史瑞，吴颂，等.血管性痴呆病因病机的研究概述［J］.中华中医药学刊，2011，29（8）：1712-1714.

［9］蔺心敬，胡常林，谢运兰，等.APOE基因多态性与血管性痴呆的实验研究［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2009，14（1）：186.

［10］Li L，Cao D，Garber DW et al.Association of aortic atherosclerosis with cerebral β-amyloidosis and learning deficits in a mouse model of Alzheimer′s disease［J］.Am J Pathol，2003，163（5）：2155-2164.

（编辑 武玉欣）

R743

A

0258-4646（2014）11-1036-03

沈阳市科技局科研基金（f10217100）

季迁（1968-），女，高级讲师，硕士.

刘芳，E-mail：liufangrui2014@163.com

2014-07-07

网络出版时间：