人组蛋白α-氨基乙酰基转移酶Nat11表达纯化、晶体生长及底物结合研究

黄嘉欣 李海涛

（清华大学医学院基础医学系，北京 100086）

人组蛋白α-氨基乙酰基转移酶Nat11表达纯化、晶体生长及底物结合研究

黄嘉欣 李海涛

（清华大学医学院基础医学系，北京 100086）

α-氨基乙酰基转移酶11（Nat11）催化组蛋白H4和H2A氨基端乙酰化修饰，发挥着重要的表观遗传调控功能。将人Nat11基因构建到原核表达载体pSUMO中，转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行重组表达。通过镍柱亲和层析等一系列体外纯化步骤，获得高纯度Nat11。利用等温滴定量热法（ITC），测得Nat11与底物多肽微摩尔量级结合常数。利用质谱技术，发现纯化后的Nat11结合有大肠杆菌内源产生的乙酰辅酶A或辅酶A，在ITC滴定过程中可以产生对多肽底物的乙酰化修饰，表明纯化获得的Nat11在溶液中具有酶活力。随后，对Nat11进行晶体生长研究，通过初筛优化获得蛋白截短体及底物-酶融合蛋白单晶。

α-氨基乙酰基转移酶11 重组蛋白表达 蛋白聚集 酶-底物结合 晶体生长

真核细胞中，蛋白质乙酰化是一种重要的翻译后修饰。除了以赖氨酸为代表的氨基酸侧链乙酰化之外，蛋白的N-末端也可以发生α-氨基乙酰化（N-alpha acetylation）。研究表明N-末端α-氨基乙酰化的蛋白质在哺乳动物细胞中占80%-90%，在酵母中约占50%-70%［1-3］，是一种较为普遍存在的乙酰化修饰。真核生物体内，蛋白质N-末端乙酰化由α-氨基乙酰基转移酶（N-alpha acetyltransferases，NATs）家族成员催化完成。在高等真核生物中，目前已鉴定出6种 NATs家族成员，分别为NatA［4］、NatB［5］、NatC［6］、NatD［7］、NatE［8］和NatF［9］；其中前5种在酵母中也被报道存在。NATs能够与核糖

体结合，以一种共翻译修饰方式完成新生多肽链N-末端的乙酰化修饰。与此同时，尤其是在人体内，很大一部分的NATs可以游离于核糖体之外存在，发挥着共翻译修饰以外的功能。蛋白氨基端乙酰化可以中和自由氨基端的正电荷，并引入额外的化学修饰基团，在蛋白质降解、蛋白-蛋白和蛋白-生物膜相互作用，以及蛋白质定位等细胞生理过程中发挥着重要调控功能。2011年，人们首次发现Nat基因突变是一种人类遗传紊乱病——Ogden综合症的分子遗传学病因［10］。患这种疾病的男孩出现全身发育延迟，而且在婴儿期就会死去，充分显示了蛋白N-末端乙酰化的重要性。

染色质的基本单位是核小体，每个核小体是由核心组蛋白八聚体以及缠绕在上面的147个碱基对DNA所组成。核心组蛋白八聚体包括H2A、H2B、H3和H4各两分子［11，12］，其中组蛋白上许多位点能发生翻译后修饰，比如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化等。这些组蛋白修饰及其组合被宽泛的定义为一类“组蛋白密码”［13-15］，发挥重要的基因表达和染色体结构调控作用。研究表明，组蛋白H2A、H2B和H4的N-末端也可以发生乙酰化修饰，而H3却不发生该修饰［16］。其中，组蛋白H2B N-末端乙酰化由NatA负责［17］，而组蛋白H2A和H4的 N-末端乙酰化却是由Nat11（亦名NatD，Naa40p）来完成，表现出组蛋白氨基端乙酰化修饰的底物特异性。研究表明，NatA还能修饰除H2B以外的许多蛋白质底物；而与NatA不同，Nat11迄今为止被发现只能特异性地修饰H2A和H4［7，16，18］。人组蛋白H2A和H4的N-末端序列非常相似，分别为S1GRGKQGGK9和S1GRGKGGKG9，相似的序列可能是它们都能被Nat11催化的分子基础。Nat11只有一个亚基，在细胞质中部分Nat11与核糖体共定位，暗示着伴随H2A和H4的合成，新生组蛋白H2A、H4多肽的N-末端发生乙酰化修饰［13，19］。同时有试验表明，人Nat11除了存在于细胞质中，在细胞核中也有分布［7］。另外，在小鼠脑细胞中有7%的H4 N-末端没有乙酰化修饰［20］，在HeLa细胞中也鉴定出约8.5%的H4 N-末端不带乙酰基［21］，这共同暗示了Nat11在细胞核中发挥某种调控作用。最近研究表明，H4 N-末端乙酰化会影响H4第3位精氨酸（H4R3）的甲基化以及核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）沉默。Nat11缺失后，会导致H4R3出现非对称二甲基化，同时rDNA沉默加剧［22］。由此可见，Nat11所催化的H4 N-末端乙酰化具有重要的表观遗传调控功能。

本研究表达纯化人Nat11进行晶体生长研究，并利用等温滴定量法测量Nat11与底物多肽、产物多肽的结合常数，旨在为进一步深入研究Nat11特异识别并催化组蛋白H2A和H4 N-末端乙酰化修饰的分子结构机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所使用的表达载体为pSUMO10，改造于表达载体pET-28b，带氨基端串联10×His-SUMO标签。PCR引物合成及基因测序由Invitrogen公司合成；PCR mixture为购自Genstar公司；限制性核酸内切酶及T4连接酶购自NEB公司；质粒抽提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为康为公司；蛋白质Marker、DNA Marker购自全式金公司；琼脂糖购自BIOWEST公司；镍亲和层析预装柱、分子筛HiLoad SuperdexTM75、脱盐柱HiPrep 26/10 Desalting Column购自GE Healthcare公司。多肽人H4（1-9）、人acH4（1-9）、人H4（1-25），购自北京中科亚光公司。所使用的晶体筛选试剂盒购自Hampton Research公司和Emerald Biosystems公司；结晶试剂购自Sigma-Aldrich公司，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人Nat11截短体及融合蛋白设计 将人Nat11与RimL进行序列比对，RimL为原核细胞鼠伤寒沙门菌蛋白质N-末端乙酰基转移酶，结构已解。设计截短体人Nat11（21-237）和（21-223）。此外，为获得人Nat11与底物H4的复合物结构，设计了底物-酶融合蛋白，将人H4 N-末端7肽（SGRGKGG）融合人Nat11（24-223）的N-末端，即H4（1-7）-Nat11（24-223）融合蛋白。

1.2.2 原核表达质粒构建 以人cDNA库为模板，PCR扩增出Nat11全长及截短体基因，并连接到pSUMO载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态中，培养单克隆，提取质粒测序，最后获得人Nat11全

长及截短体的原核表达质粒。

1.2.3 人Nat11全长及截短体蛋白表达 将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。挑取单克隆菌落37℃培养，至菌液OD600为0.8-1.0，降温至25℃，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至0.2 mmol/L，过夜诱导。

1.2.4 重组蛋白镍柱亲和层析纯化 收集菌体，用缓冲液20 mmol/L Tris（pH8.5），500 mmol/L NaCl重悬，破碎后高速离心。将上清液上样到镍柱，先用裂解缓冲液除去不结合镍柱的杂蛋白，随后逐渐提高咪唑浓度，重组蛋白在含约95 mmol/L咪唑的缓冲液中洗脱出来。蛋白溶液中加入含6×His标签的重组SUMO蛋白酶ULP1，4℃过夜酶切SUMO。Nat11 N-末端的His-SUMO标签蛋白会被ULP1切除。

1.2.5 目的蛋白与His-SUMO、His-ULP1分离 在过夜酶切的蛋白溶液加入10 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），浓缩，过脱盐柱HiPrep 26/10 Desalting Column，缓冲液为重悬缓冲液。蛋白溶液上样到镍柱，由于目的蛋白不带有His标签，不结合镍柱，因此柱流出液中含有目的蛋白，将流出液收集即可得到目的蛋白。SUMO及ULP1的N端带有His标签，流经镍柱时会与镍柱结合，从而与目的蛋白分离。

1.2.6 分子筛进一步纯化人Nat11蛋白溶液 加入新鲜DTT至5 mmol/L浓缩，上样到分子筛HiLoad SuperdexTM75中，用缓冲液20 mmol/L HEPES（pH 7.5），100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT洗脱。280 nm紫外分光检测蛋白质浓度，分装，在液氮中速冻，于-80℃保存。

1.2.7 全长蛋白晶体生长 人Nat11全长蛋白二聚体分别与CoA或AcCoA按摩尔比1∶3相混，冰上孵育2 h，使用商业试剂盒Structure Screen I、II，Crystal Screen I、II以及Natrix I进行初筛，坐滴，1 μL蛋白混合物溶液与1 μL结晶试剂相混，18℃静置。长出晶体，并对条件进行优化。

1.2.8 截短体人Nat11（21-237）纯化及晶体生长 截短体人Nat11（21-237）与AcCoA按摩尔比1∶3相混，冰上孵育2 h，筛选试剂盒Index和Structure Screen I、II时，在池液中添加新鲜DTT至10 mmol/L。长出晶体后，对条件进行优化。

1.2.9 底物-酶融合蛋白晶体生长 融合蛋白H4（1-7）-Nat11（24-237）与AcCoA按摩尔比1∶3相混，冰上孵育2 h，筛选试剂盒Index和Structure Screen I、II时。长出晶体后，对条件进行优化。

1.2.10 等温滴定量热法（ITC）测定截短体对底物及产物结合能力 在25℃ 1 mmol/L底物多肽H4（1-9）对0.1 mmol/L截短体Nat11（21-223）进行ITC滴定，用于稀释多肽和蛋白的缓冲液成分为20 mmol/L HEPES（pH7.0），100 mmol/L NaCl。

1.2.11 质谱分析 将ITC滴定产物和底物-酶融合蛋白进行质谱MALDI-TOF分析。

2 结果

2.1 人Nat11原核表达质粒构建

pSUMO原核表达载体改造于pET-28b，N端标签是带有10个His的SUMO蛋白，SUMO对于蛋白质折叠有促进作用，能提高蛋白质的溶解度。蛋白酶ULP1特异性识别SUMO的三维结构，并在其C端酶切，酶切后目的蛋白的N-末端会残留一个氨基酸丝氨酸。由于H4 N-末端第一位氨基酸正是丝氨酸，所以底物-酶融合蛋白使用pSUMO载体，能确保融合蛋白中底物位点不被屏蔽。此外，Nat11全长蛋白很难获得单晶，因此通过与RimL序列比对，设计了截短体人Nat11（21-237）和（21-223）。

2.2 重组蛋白镍柱纯化结果

在25℃，0.2 mmol/L IPTG过夜诱导下，80%重组蛋白为可溶性表达。重组蛋白带有His标签，能与镍柱结合，而杂蛋白不结合或只有微弱结合，因此镍柱能分离重组蛋白与杂蛋白。咪唑会与重组蛋白竞争结合镍柱，逐渐提高咪唑浓度，能将重组蛋白洗脱下来。重组蛋白在大约95 mmol/L咪唑浓度下被洗脱下来。

2.3 His-SUMO标签蛋白与目的蛋白分离

镍柱纯化后，使用SUMO蛋白酶ULP1将Nat11 N端的标签蛋白His-SUMO切掉。由于SUMO和ULP1的N端都有His标签，通过再次过镍柱，反挂除去，进而实现目的蛋白的纯化。值得注意的是，经过第一次镍柱纯化后，溶液中含有咪唑，会影响His-SUMO及His-ULP1结合镍柱，所以先使用脱盐柱将咪唑除去。此外，上脱盐柱前，蛋白质浓缩时加入DTT，由于DTT会螯合镍柱上的镍离子，所以

脱盐柱缓冲液不含有DTT。利用脱盐柱除去蛋白溶液中的咪唑及DTT。经SDS-PAGE鉴定，发现反挂镍柱的流出液中不存在SUMO及ULP1组分，只有目的蛋白条带。

2.4 分子筛纯化Nat11及Nat11聚集研究

利用蛋白质分子量差异，使用分子筛HiLoad SuperdexTM75进一步纯化蛋白质Nat11。浓缩及分子筛缓冲液中不含有还原剂时，全长蛋白过分子筛时发现出现3个峰（图1-A），根据出峰位置与蛋白分子量的对应关系，这3个峰分别对应着高聚体，二聚体和单体。经SDS-PAGE检测蛋白质纯度，发现不管是二聚体蛋白还是单体蛋白，纯度都达到95%以上，而高聚体则存在少量大分子量的杂蛋白。由于蛋白质分子发生聚集会导致状态不均一，进而影响晶体生长。为解决这一问题，我们尝试改变缓冲液pH。使用3种不同pH的缓冲液，分别为NaAc（pH4.5），Bis-Tris（pH6.3）和HEPES（pH7.5）发现在不同pH的缓冲液中，蛋白质依旧出现聚集峰，这说明pH改变并不能改善蛋白质聚集。分析Nat11序列发现，Nat11全长序列中含有10个半胱氨酸，可能会导致分子间交联，引起蛋白质聚集，因此在浓缩过程加入新鲜DTT至5 mmol/L，并在分子筛缓冲液中也添加2 mmol/L DTT。经过分子筛后，发现高聚体和二聚体含量明显下降，单体成为主要成分（图1-B）。由此可见，使用还原剂DTT破坏二硫键形成，能有效改善蛋白的聚集行为。

2.5 等温滴定量热法（ITC）检测Nat11对H4结合

还原剂DTT的存在会造成ITC滴定体系基线漂移。在没有DTT的环境下，为尽量降低蛋白质的聚集情况，使用新鲜纯化的截短体Nat11（21-223）单体进行ITC滴定。分别使用底物H4（1-9）多肽和产物acH4（1-9）多肽滴定蛋白，测量结合常数。经后续质谱检测，发现蛋白溶液中含有AcCoA和CoA，所以底物多肽滴定时会发生乙酰化反应，另外结合的AcCoA可能会对产物多肽与蛋白结合有抑制作用，所以测得的结合常数为表观结合常数，底物多肽与蛋白的表观结合常数（Kd）为1.1 μM；产物多肽与蛋白的表观结合常数为4.6 μM（图2）。

图1 人Nat11全长蛋白聚集情况

2.6 质谱结果分析

将用于进行ITC的蛋白溶液进行质谱分析，发现溶液中存在AcCoA和CoA（图3-A），由于蛋白质表达以及纯化时并没有添加AcCoA和CoA，因此推测来源于大肠杆菌，Nat11在表达及后续纯化过程中，一直保持结合状态。所结合的CoA是发生催化反应后由AcCoA转变而来的，还是直接结合的，还需要进一步确证。底物H4（1-9）多肽滴定蛋白质后，质谱分析发现，溶液中同时存在H4（1-9）和乙酰化的H4（1-9）（图3-B），而且只有CoA，并没有AcCoA，这说明了在滴定时，发生了乙酰化反应，与蛋白质结合的AcCoA被消耗完，但由于蛋白含量少于AcCoA，所以只有部分底物被乙酰化。此外，产物多肽滴定蛋白质，无法发生乙酰化反应，所以同时存在AcCoA和CoA。

由于Nat11在表达纯化过程中结合大肠杆菌中的AcCoA，因此猜测底物-酶融合蛋白表达时也会结合AcCoA。质谱分析融合蛋白，发现只有CoA，没有AcCoA，而且蛋白质的分子质量比理论分子质量多了42（图3-D），为一个乙酰基的大小，这表明融

合蛋白确实结合了大肠杆菌中的AcCoA，并且利用其作为底物，发生了自我乙酰化。

图2 等温滴定量热法测量Nat11截短体（21-223）与底物多肽、产物多肽的表观结合常数

2.7 晶体生长

把人Nat11全长蛋白与CoA或AcCoA相混进行晶体生长，可以在多个条件长出成簇针状微晶（图4-A），但难以优化并进行衍射数据收集。为解决该问题，尝试使用截短体Nat11（21-237）进行晶体筛选，最后在Structure Screen I 的第7号条件：0.2 mol/L NH4Ac，0.1 mol/L Na3Citrate，pH5.6，30% PEG 4K，10 mmol/L DTT 中长出截短体Nat11与AcCoA复合物的片状晶体（图4-B）。随后优化条件，最后沉淀剂换成30% PEG 3350，能重复出一样的晶体。在点晶体时发现，将蛋白质与结晶试剂相混，会立刻出现白色小颗粒状沉淀，随着沉淀剂PEG 3350的浓度提高，沉淀会变严重。但18℃静置1 d后，沉淀就会消失，随后晶体长出来。

由于质谱结果（图3-D）显示，底物-酶融合蛋白能发生自我乙酰化，所以推测底物部分与酶结合了，故用此融合蛋白进行晶体生长，获得复合物结构。底物-酶融合蛋白与AcCoA及CoA混合物均在Structure Screen II的1号条件：0.1 mol/L sodium chloride，0.1 mol/L Bicine（pH9.0），30% PEG 550 MME中10 d后长出晶体（图4-C）。

3 讨论

在真核细胞中，蛋白质N-末端乙酰化普遍存在，其中核小体核心组蛋白H2A、H2B和H4都能发生该修饰，而H3则不发生。特异性乙酰化H2A和H4的酶是Nat11，人Nat11在细胞核中有分布，暗示着Nat11在细胞核中起着某种调控作用。

本试验根据序列比对及序列分析，构建Nat11全长蛋白、截短体以及底物-酶融合蛋白-pSUMO原核表达体系。经大肠杆菌表达，经过镍柱亲和层析初步纯化，ULP1酶切His-SUMO，脱盐柱除咪唑，二次镍柱除去His-SUMO及His-ULP1，最后通过分子筛，对蛋白质进一步纯化。使用的分子筛是HiLoad SuperdexTM75，分离范围为3-70 kD。由于分子筛对上样量的体积有要求，所以在上分子筛前需要浓缩蛋白质。浓缩后过分子筛，发现出现蛋白质高聚体峰，二聚体峰和单体峰，表明发生了蛋白质聚集，而且有高聚化。通过改变分子筛缓冲液pH值，发现对于聚集问题并没有改善。分析全长序列发现，Nat11含有10个半胱氨酸，聚集可能是由于分子间产生二硫键交联，因此在浓缩时加入5 mmol/L DTT，并在分子筛缓冲液中加入2 mmol/L DTT，此时发现高聚体和二聚体含量明显下降，单体成为主要成分，由此说明蛋白聚集是因为分子间形成二硫键，使用还原剂能极大地改善这一现象。

图3 ITC滴定体系及底物-酶融合蛋白质谱结果

从质谱结果得知，高纯度Nat11截短体（21-223）溶液中含有AcCoA和CoA，由于没有人为添加，所以AcCoA和CoA均为大肠杆菌内源产生，而且在纯化时一直与蛋白结合。Nat11结合AcCoA，在底物多肽ITC滴定蛋白质时，发生了乙酰基转移反应。

由于Nat11含量低于多肽，即与蛋白结合的AcCoA含量低于多肽，所以只有部分底物多肽被乙酰化，全部AcCoA转化为CoA。产物多肽滴定蛋白，没有乙酰化反应，AcCoA和CoA共存。H4多肽对Nat11滴定峰为倒峰，意味着结合是放热反应。而底物多肽滴定时发生的乙酰化反应也是放热反应，所以ITC量热应为两者的共同贡献，所测得的表观结合常数1.1 μM应比实际结合常数大。部分Nat11结合AcCoA，AcCoA的存在可能对产物多肽结合蛋白有抑制作用，所以测得的表观结合常数4.6 μM应比实际结合常数小。从两个反应的表观结合常数可看出，底物和产物与蛋白的实际结合常数均应为4.6-1.1 μM之间。后续将通过设计不影响结合的催化残基突变体，来测定实际结合常数。

图4 Nat11晶体生长

另外，质谱分析底物-酶融合蛋白溶液，发现溶液中只含有CoA，并且蛋白质的分子量比理论分子量多了42，正好是一个乙酰基的大小，因此我们认为，融合蛋白也能在表达时结合大肠杆菌生产的AcCoA，并且发生自身乙酰化。

4 结论

本研究成功将人Nat11全长，截短体及底物-酶融合蛋白基因构建到原核表达载体，利用一系列纯化手段，获得了高纯度Nat11，发现还原剂DTT能改善蛋白质聚集这一问题。使用高纯度Nat11进行晶体生长，最后获得截短体（21-237）以及底物-酶融合蛋白单晶。同时ITC测得Nat11与底物多肽微摩尔量级结合常数。质谱结果显示，Nat11及底物-酶融合蛋白在表达纯化时会结合大肠杆菌生产的AcCoA及CoA，底物-酶融合蛋白还会发生自身乙酰化。

［1］Starheim KK, Gevaert K, Arnesen T. Protein N-terminal acetyltransferases：when the start matters［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2012, 37（4）：152-161.

［2］Arnesen T, Van Damme P, Polevoda B, et al. Proteomics analyses reveal the evolutionary conservation and divergence of N-terminal acetyltransferases from yeast and humans［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106（20）：8157-8162.

［3］Polevoda B, Sherman F. N-terminal acetyltransferases and sequence requirements for N-terminal acetylation of eukaryotic proteins［J］. Journal of Molecular Biology, 2003, 325（4）：595-622.

［4］Gromyko D, Arnesen T, Ryningen A, et al. Depletion of the human Nα-terminal acetyltransferase A induces p53-dependent apoptosis and p53-independent growth inhibition［J］. International Journal of Cancer, 2010, 127（12）：2777-2789.

［5］Starheim K, Arnesen T, Gromyko D, et al. Identification of the human Nalpha-acetyltransferase complex B（hNatB）：a complex important for cell-cycle progression［J］. Biochem J, 2008, 415：325-331.

［6］Starheim KK, Gromyko D, Evjenth R, et al. Knockdown of human Nα-terminal acetyltransferase complex C leads to p53-dependent apoptosis and aberrant human Arl8b localization［J］. Molecular and Cellular Biology, 2009, 29（13）：3569-3581.

［7］Hole K, Van Damme P, Dalva M, et al. The human N-alphaacetyltransferase 40（hNaa40p/hNatD）is conserved from yeast and N-terminally acetylates histones H2A and H4［J］. PloS One, 2011, 6（9）：e24713.

［8］Evjenth R, Hole K, Karlsen OA, et al. Human Naa50p（Nat5/San）displays both protein Nα-and Nε-acetyltransferase activity［J］. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284（45）：31122-31129.

［9］Van Damme P, Hole K, Pimenta-Marques A, et al. NatF contributes to an evolutionary shift in protein N-terminal acetylation and is important for normal chromosome segregation［J］. PLoS Genetics, 2011, 7（7）：e1002169.

［10］Rope AF, Wang K, Evjenth R, et al. Using VAAST to identify an X-linked disorder resulting in lethality in male infants due to N-terminal acetyltransferase deficiency［J］. The American Journal of Human Genetics, 2011, 89（1）：28-43.

［11］Kornberg RD, Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome［J］. Cell, 1999, 98（3）：285-294.

［12］Luger K, Richmond TJ. The histone tails of the nucleosome［J］. Current Opinion in Genetics & Development, 1998, 8（2）：140-

146.

［13］Strahl BD, Allis CD. The language of covalent histone modifications［J］. Nature, 2000, 403（6765）：41-45.

［14］Portela A, Esteller M. Epigenetic modifications and human disease［J］. Nature Biotechnology, 2010, 28（10）：1057-1068.

［15］Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy［J］. Nature, 2004, 429（6990）：457-463.

［16］Song OK, Wang X, Waterborg JH, Sternglanz R. An Nalpha-acetyltransferase responsible for acetylation of the N-terminal residues of histones H4 and H2A［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278（40）：38109-38112.

［17］Mullen JR, Kayne P, Moerschell R, et al. Identification and characterization of genes and mutants for an N-terminal acetyltransferase from yeast［J］. The EMBO Journal, 1989, 8（7）：2067-2075.

［18］Polevoda B, Hoskins J, Sherman F. Properties of Nat4, an N（alpha）-acetyltransferase of Saccharomyces cerevisiae that modifies N termini of histones H2A and H4［J］. Molecular and Cellular Biology, 2009, 29（11）：2913-2924.

［19］Polevoda B, Brown S, Cardillo TS, et al. Yeast N（alpha）-terminal acetyltransferases are associated with ribosomes［J］. Journal of Cellular Biochemistry, 2008, 103（2）：492-508.

［20］Tweedie-Cullen RY, Brunner AM, Grossmann J, et al. Identification of combinatorial patterns of post-translational modifications on individual histones in the mouse brain［J］. PloS One, 2012, 7（5）：e36980.

［21］Young NL, DiMaggio PA, Plazas-Mayorca MD, et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2009, 8（10）：2266-2284.

［22］Schiza V, Molina-Serrano D, Kyriakou D, et al. N-alpha-terminal acetylation of histone H4 regulates arginine methylation and ribosomal DNA silencing［J］. PLoS Genetics, 2013, 9（9）：e1003805.

（责任编辑 马鑫）

Expression，Crystallization and Substrate Binding Studies of Human Histone N-terminal Acetyltransferase Nat11

Huang Jiaxin Li Haitao
（Department of Basic Medical Sciences，School of Medicine，Tsinghua University，Beijing 100086）

The alpha-amino groups of histones H4 and H2A can be acetylated by histone N-terminal acetyltransferase 11（Nat11）, which plays an important role in epigenetic regulation. The cDNA of human Nat11 was amplified and cloned into pSUMO vector. The resultant construct was transformed into E.coli strain BL21（DE3）for recombinant protein expression. Homogenous Nat11 was highly purified through a series of purification procedures including nickel column affinity chromatography. Using isothermal titration calorimetry（ITC）, we measured micromolar binding constants between Nat11 and histone H4 peptides. MALDI-TOF mass spectrometry analysis revealed that purified Nat11 was pre-bound with acetyl coenzyme A or coenzyme A that was co-purified from E.coli. After ITC titration using unmodified peptide as ligand, N-acetylated product was detected by mass spectrometry, suggesting that the purified Nat11 is active. We performed crystallization screening and successfully obtained single crystal of a truncate form of Nat11 and substrate-enzyme recombinant protein after optimization.

Alpha-amino acetyltransferase 11 Recombinant protein expression Protein aggregation Enzyme-substrate binding Crystallization

2014-04-08

科技部“973”项目（2011CB965303），2012教育部新世纪优秀人才支持计划

黄嘉欣，女，硕士研究生，研究方向：结构表观遗传学；E-mail：hjx.star@163.com

李海涛，博士，教授，研究方向：结构表观遗传学；E-mail：lht@tsinghua.edu.cn