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哺乳动物中RNA干扰沉默基因表达的研究进展

2014-03-21曹腾威谷凌云黄和3高振郦明芳

生物技术通报 2014年11期
关键词:原代脂质体碳纳米管

曹腾威谷凌云黄和,3高振郦明芳

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,南京 211816;2.东南大学附属江阴医院,江阴 214400;3.材料化学工程国家重点实验室,南京 210009;4.南京医科大学第一附属医院,南京 210029)

哺乳动物中RNA干扰沉默基因表达的研究进展

曹腾威1谷凌云2黄和1,3高振1郦明芳4

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,南京 211816;2.东南大学附属江阴医院,江阴 214400;3.材料化学工程国家重点实验室,南京 210009;4.南京医科大学第一附属医院,南京 210029)

RNA干扰及相关基因沉默导致的代谢通路变化已经彻底改变了人们对基因调控的理解。基因沉默技术已经被用来作为一种研究工具来控制某些细胞基因的表达,特异的siRNA导入不同的细胞需要不同的转染载体才能达到最大的转染效率,并且不会产生较大的细胞毒性。近年来尤其是碳纳米管等新型纳米材料载体的应用拓展了人们对传统脂质体和病毒载体的认识。首先介绍RNA干扰技术及其发展历程,随后对利用几种不同的载体来设计和进行RNA干扰试验进行了比较,最后对最初的脂质体到生物病毒再到高分子纳米材料介导的RNA干扰在疾病的治疗和临床诊断进行了展望。

RNA干扰 小干扰RNA 基因沉默 转染 碳纳米管

随着人类基因组计划的完成,越来越多生物的全基因组被测序,人们对功能基因组学的研究越来越深入。研究思路通常从两个方面展开,一是增强某种基因表达,研究过表达后引起的一系列机理;二是减弱或者终止其表达,进而推测该基因相应的生理功能。基于后者针对性很强的特点,逐渐发展成一种新技术——基因沉默(Gene silencing)。

从低等原核生物到高等真核生物,基因沉默技术的广泛应用推动了基因组学研究的革命化进程。在微生物代谢工程中,提高目标产物的产量、纯度以及诱导出新的有价值产物都是人们亟待解决的问题,特定基因的敲除技术的应用给人们带来了解决问题的希望。人们通过不断改造工程菌株,改变其代谢途径,阻断其代谢旁路,使其利于向目标产物

积累的方向进行,以获得的大量的代谢产物。因此可以利用转座子突变系统、同源重组系统或者自杀载体[1]进行基因位点的定向敲除。在真核生物中,RNA干扰(RNA interference)作为基因沉默的另一种途径操纵着许多细胞功能。尤其在哺乳动物中它能够调控基因的表达,分析信号传导基因间相互作用,阻断病变基因信号通路。本研究就通过多种方法进行RNA干扰细胞引起基因沉默展开综述,并且重点阐述了新型高分子材料可以作为一种高效载体携带小核酸分子进入细胞,为RNA干扰的研究提供了新的研究思路。

1 RNA干扰

1995年,Guo和Kemphues[2]在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans中发现了RNA干扰现象。直到1998年,Fire和Mello等[3]通过注射与秀丽隐杆线虫机体同源基因(靶基因)的双链RNA,阻断了靶基因的表达,并将其命名为RNA干扰。随后关于RNA干扰现象的研究表明,在植物、果蝇、锥虫、涡虫等许多生物中都存在此种现象。1999年,Tuschl等[4]报道了在哺乳动物中也存在RNA干扰现象。2001年,Ketting等[5]研究人员提出,只有22个核苷酸的siRNA才能特异性的阻断dsRNA(double-strand RNA)并在体内发现了一个将dsRNA分解为siRNA的酶(DICER)。

RNA干扰技术已经成功的从植物研究发展到哺乳动物的相关研究,并且逐步被应用到医学上一些顽疾的治疗研究。Lee等[6]用siRNA抑制艾滋病病毒HIV的一些基因,如p24、vif、nef抑制和HIV特异结合的细胞表面受体CD4和CD8a或辅助受体CXCR4/CCR5或病毒结构Gag蛋白的表达,阻碍HIV感染细胞。Weber等[7]利用聚乙亚胺和聚乙二醇融合后可提高siRNA的稳定性和减少其毒性,证明其可作为药物作用淋巴细胞,并最终测定该共聚物的生物学效果:靶向干扰了HIV的nef。

对于RNA干扰的作用机制目前认为有两种:一种是存在于线虫、真菌和植物中依赖RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)的干扰途径;另一种是存在于果蝇和哺乳动物中不依赖RdRP的干扰途径[8]。RNA干扰具有4个分子生物学特征:典型的转录后基因沉默;高效沉默目的基因表达;高度序列特异性;dsRNA具有扩散性。只要在生物细胞内产生dsRNA,就可以对特定的基因实施转录后基因表达的沉默。生化和遗传研究表明,RNA干扰包括起始阶段、效应阶段和扩增阶段。在起始阶段,小分子RNA被Dicer酶切割成21-23 bp长的siRNA。研究表明,该Dicer酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种依赖ATP的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA,将RNA降解为19-21 bp的双链RNA。在效应阶段,siRNA和一个核蛋白粒子(RNPs)结合,分别形成siRNA核蛋白复合物和miRNA核蛋白复合物,然后重排为RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。激活RISC是一个依赖ATP siRNA解链的过程。RISC中的siRNA引导沉默复合物识别同源靶mRNA,然后RNA解旋酶使靶向mRNA与siRNA正义链换位,在ATP的参与下,RNase在距离siRNA 3'端12个碱基的位置切割mRNA,并使其降解,从而达到转录后基因沉默的结果。在扩增阶段,由于线虫、真菌和植物以及果蝇和哺乳动物各自的RdRP的干扰途径不同,在大部分真菌、线虫和植物中主要以siRNA为引物,目的mRNA为模板合成大量的dsRNA,后者又可作为RISC的底物而被降解形成新的siRNA,新siRNA又可以进入上述循环,使信号放大(图1)[9]。

2 siRNA的设计与制备

siRNA的结构和功能之间存在相关性。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是以21-23 nt的siRNA为媒介的,这种siRNA具有5'末端的磷酸基,3'末端的羟基和2个突出的单链核苷酸[10,11]。这种特殊的3'端有突出的非配对碱基结构有利于提高siRNA的稳定性,使其在细胞内可稳定存在3-4 d[12]。有许多方法可以提高制备高效siRNA的可能性,其中关键的方法就是靶基因的位点的选取。在基因库中寻找靶向基因的mRNA序列,并从开放阅读框ORF起始密码AUG后的第100-200 nt开始寻找AA(N19)UU序列,其中N19为任意19 nt的mRNA核苷酸序列,然后设置选定序列中的G+C比例为30%-60%,

对确定的序列用NCBI的Blast(www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST)搜索。搜索结果中和其他基因有16个以上碱基同源序列的要被筛除,以确定所作用靶基因是唯一的[13]。这样得到的siRNA特异性很高,能特异结合目的mRNA,诱使转录后基因沉默。

图1 RNA干扰机理模式图[9]

以往传统的siRNA设计原则包括:序列中G+C所占比例;siRNA双螺旋与靶基因的热力学参数等。随着研究的深入,siRNA设计原则逐渐规范化。Ui-Tei等[14]提出4个设计高效siRNA指标:反义链的5'末端是A/U;正义链的5'末端是G/C;反义链5'末端的1/3富含AU;不含GC序列长度超过9个bp。最近El-Lakkani等[15]研究如何从哺乳动物基因筛选出高效的siRNA位点。他们把3 734个siRNA按照高、中、低效率分成3组,运用在线数据库分析设计出更高效率的siRNA方法。碱基的位置和热力学稳定性关系到高效率siRNA的设计过程,El-Lakkani通过13种设计原则(A/U和C/G位置、ΔG)发现设计出高效率siRNA最关键是反义链5'和3'末端结合能的大小。由于siRNA设计方法的逐步完善,生物学家们已经开发出许多针对性的算法和在线软件。其中siDirect(http://design. RNAi.jp/)就是一款设计最大靶向特异性siRNA的在线软件,它利用BLAST筛除掉交叉杂合子来避免产生有脱靶效应的siRNA。然而与其他在线设计软件一样(siRNA target finder, siDEDIGN center)siDirect也不能避免BLAST搜索的局限性,所以更精确软件有待开发来确保靶向干扰的高效特异性[16]。2013年,Boudreau等[17]介绍了一个新的siRNA设计工具siSPOTR。利用公认的siRNA数据完成超过50个微阵列芯片试验,在此基础上建立了预测潜在脱靶效应的生物信息学方法,并基于此种方法开发出具有特异的siRNA设计算法和在线软件。脱靶效应(假阳性率和毒性反应)是基因沉默技术的一大难题,尤其在RNA干扰基因治疗中。与其他的设计软件不同,siSPOTR可以生成很多的低脱靶概率的序列,提供了更宽的平台来让用户筛选。与其他的软件相比,Boudreau等证明了这种方法设计的序列能降低脱靶概率5%-10%。

3 siRNA的传递载体

siRNA是RNA干扰作用细胞的最终形式与载体,所以各种方法的最终目的就是获得高效特异的siRNA,并且成功使其在细胞内发挥作用,使靶基因沉默。目前可通过5种方法获得siRNA:化学合成、体外转录、RNA酶类物质(RNaseⅢ和Dicer)降解dsRNA、siRNA表达载体或者病毒载体、siRNA表达框架。前3种是通过体外制备然后再导入到靶细胞中,后2种是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动物或细胞中转录生成siRNA。获得特异性的目标siRNA后,无论通过哪种传递载体,最终的目的是使siRNA作用于靶基因。由于转染效率与转染试剂、细胞种类、细胞生长状态、转染方法及siRNA浓度等条件密切相关[18]。所以把siRNA高效地导入受体细胞是RNA干扰作用的瓶颈步骤。另外RNA作为生物大分子一般不容易透过细胞膜进入胞内,尤其是一些非分化细胞、原代细胞和干细胞,所以寻找一种合适的转染方式极为关键。

谷凌云等[19]的研究是从细胞水平上特异沉默靶基因后探究心房结构重构与房颤的关系。以新生原代大鼠心房肌细胞为模型,对于原代这类难转染的细胞有文献报道用化学合成的方法获得siRNA,并和转染试剂TransIT-TKO以及Opti-MEM无血清培养基共孵育转染原代心房肌细胞,siRNA转染浓度随着细胞密度大小从50 nmol/L升高到250 nmol/L不等。我们采用100 nmol/L的siRNA并按照图2的流

在给排水工程施工过程中经常会出现各种不同类型的问题,这会对给排水工程的质量造成不良影响,进而都会其应用性能产生影响,可见,在给排水工程施工中,做好像施工管理意义重大。

程成功达到了较高的转染效率[20]。

图2 用化学合成siRNA进行的典型RNAi试验示意图[20]

3.1 脂质体和病毒

由于siRNA相对分子质量较大(14 000以上)和带有较高的负电荷,不能自发穿过细胞膜进入细胞内[21]。脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物。例如,一个约5 kb的质粒可以结合2-4个脂质体,被俘获的DNA就会随着质粒载体导入培养的细胞。

文献报道阳离子脂质体有Invitrogen公司的Lipfectamine 2000,Oligofectamine和 Lipofectamine RNAiMAX[22]。比较了这3种阳离子脂质体在间充质干细胞和新生干细胞中转染Oct4的siRNA时的效率。结果显示,Lipofectamine RNAiMAX是一种将siRNA传递到人胚胎干细胞中完美的转染试剂,并且它较低的细胞毒性不会影响到干细胞的全能性。李杰等[23]应用脂质体siPORT NeoFX介导从5-30 nmol/L,4个梯度浓度的CY-Negative siRNA转染心肌细胞。转染24 h后检测转染效率和细胞凋亡率,测得siRNA在30 nmol/L时平均转染率达76.67%,故siPORT NeoFX转染原代心肌细胞在siRNA浓度30 nmol/L时达到最佳效果。同样,王玉洁等[24]也应用Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导siRNA转染原代肝癌细胞筛选最佳的转染试剂,DharmaFECT1为Thermo Scientific公司的一种全新的转染试剂。通过Realtime PCR检测出RNAiMAX转染效率最高,并用细胞增殖(MTT法)检测结果表明RNAiMAX对原代肝癌细胞没有表现出细胞毒性(表1)。

表1 不同的靶细胞和转染试剂间比较

虽然对于大部分真核细胞,脂质体介导的siRNA的转染优点很多,但转染多以瞬间表达为主,最长也不过几天。并且在某些种类的细胞转染率很低,即使在同种细胞中,转染率也大不相同。然而病毒可以携带一些大的片段DNA。如腺病毒构建系统[27]AdEasy system载体可以容纳7.5 kb外源DNA。所以病毒被广泛用于转染原代细胞,干细胞和非分化细胞。

腺病毒(Adenovirus)是一种没有包膜的线状双链DNA,它在核内以神经元细胞的形式复制,存在多种AV血清型。目前构建的绝大多数是基于血清型2和5,通过转基因的方法取代E1或E3基因,降低病毒的复制能力。腺病毒载体能够在增殖和非增殖细胞中高效传递和表达基因[28]。神经胶质瘤在成年人神经系统中是一种最常见的肿瘤,多形性成胶质细胞瘤属于甲等4级,一种公认的致病原因是体内过表达碱性成纤维生长因子(Fibroblast growth factor,bFGF)。Liu等[29]用腺病毒载体携带bFGF siRNA(Ad-bFGF-siRNA)作用于神经胶质瘤细胞阻断bFGF的表达,从而抑制肿瘤增殖。慢病毒

基因异常表达是导致许多疾病的主要原因。RNA干扰技术的终极目标之一就是开发新一代的药物,使之靶向作用相关疾病的异常mRNA。目前,许多利用RNA干扰的基因治疗正在进行临床试验。例如,抗病毒、抗肿瘤和遗传性疾病。近来,Sakurai等[30]运用一种对PH敏感由阳离子脂质YSK05构成的脂质体MEND(Multifunctional envelope-type nanodevice)传递siRNA进入肿瘤组织中。肿瘤组织中聚乙二醇化的YSK-MEND可以将siRNA浓度从0.007 9%提高到1.9% ID/g,从而使目标基因表达降低了50%。他们在褐瘤小鼠体内通过瘤内注射试验证实了包含YSK05的MEND比普通的商业化转染试剂(Lipo2000)具有更好的基因沉默能力。此外,由于具有合适的PKa,YSK05在血液呈中性状态,所以MEND-YSK05仅需要少量的聚乙二醇修饰就可以充分发挥效应,并且非常适合在肿瘤组织中传递siRNA。

3.2 碳纳米管

在很长一段时间内,阳离子脂质体、病毒一直是人们使用的最普遍的siRNA转运载体。但是在基因治疗和RNA干扰靶向药物的应用中仍然存在缺陷。对于原代细胞、免疫细胞脂质体的转染效率还是不够高[31]。虽然病毒载体具有转染效率高的优点,但是过程复杂,周期比较长,还可能引发细胞发生突变及免疫反应。另外,由于siRNA在体内稳定性差容易被核酸酶降解、难以穿过由磷脂双分子层构成的细胞膜等问题[32]。因此,一个更合理的运载系统便成为人们研究的热点(表2)。

表2 非脂质体转染途径比较

在过去的二十几年里见证了纳米科技在基因治疗领域的飞速发展,与此同时更多的载体被用来提高基因转运的效率。包括阳离子脂质体、高分子聚合物、树突状高分子、多肽类和碳纳米管被开发作为基因治疗的载体[33]。Wang等[34]阐述了石墨烯和氧化石墨烯的生物学功能以及在生物工程上的应用。碳纳米管(Carbon nanotubes,CNT)属于碳同素异形体的富勒烯家族,是由一系列碳原子经sp2杂化形成的同轴中空管状结构,碳纳米管按石墨烯片的层数可分为:单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。由于其钠针状结构使之更容易直接穿过质膜就像独立的内吞作用一样,并且穿膜后不会诱导细胞凋亡,此外,碳纳米管结构具有非常大的比表面积,使之很容易与配体结合修饰功能化。可以在红外光区监测到碳纳米管的拉曼光谱和荧光信号,因此可以利用这种特性追踪碳纳米管携带的药物在体内代谢情况。近年来,碳纳米管在分子生物学、生物医学、细胞生物学领域的研究日益增多,已经广泛被用于体内外的药物、抗原和核酸的传递。

Bianco等[35]首先运用碳纳米管这一新的基因传递载体系统,并用Prato反应共价修饰碳纳米管。他们还发现DNA-CNT复合物不会对那些被激活或未被激活的淋巴细胞表现出促有丝分裂和毒性,而这与其他非病毒基因载体相比有较大的不同。Kam等[36]把聚乙二醇化的磷脂分子与二硫键相连,磷脂分子的尾部非特异性吸附结合于碳纳米管表面。当用这种方法构建的复合物进入溶酶体后促使酶解从而释放siRNA,进而有效地干扰目的基因的表达,而且沉默效率比阳离子脂质体引起的沉默效率还高。Yang等[37]利用阳离子辅助聚合纳米粒子包装siRNA,使其能进行高效传递,进而抑制肝癌细胞中PLK1的表达,并且还能显著诱导肝癌细胞的凋亡。Podesta等[38]通过氨基加成的方法功能化多壁碳纳米管(MWNT-NH3+),使之复合siTOX siRNA

干扰癌基因的表达。他们用阳离子脂质体传递系统(DOTAP)和功能化的多壁碳纳米管(f-MWNTs)建立人的肺癌移植瘤小鼠模型。试验结果显示,试验组小鼠的肿瘤生长得到有效抑制,且小鼠存活期得到明显延长。他们也是首次在体内试验中把碳纳米管与阳离子脂质体两种转运siRNA载体的转运效率进行对比,相比于脂质体碳纳米管携带siRNA更能温和地进入肿瘤细胞。Al-Jamal等[39]把携带caspase-3 siRNA化学功能化的碳纳米管通过三维定位注射方法导入到大脑基因区,然后在ET-1诱导的中风啮齿动物大脑皮质区发现神经退变的缓解和功能性恢复。这是第一次利用碳纳米管把siRNA导入中枢神经系统。所以碳纳米管作为siRNA转运载体在基因治疗领域的研究逐步被人们所认识。

碳纳米管介导的基因传递在体内治疗仍处于初始阶段,目前所有的体内试验报道都是关于局部瘤内注射。此外,对环境和健康潜在的毒性已经成为一个亟待解决的问题。系统地研究DNA/siRNA-CNT复合物的稳定性、血循环和药代动力学,对碳纳米管药物在体内吸收、沉积、代谢和排泄一系列路径作一个长远研究,只有解决这些问题,才可能建立一个关于碳纳米管药物的GMP规范,使之更广泛的运用于临床治疗研究[40]。

4 结语

在过去的多年中,细胞通过沉默同源基因来应答dsRNA这种方式揭示了一种新的生物学管理范式。随着RNA干扰途径的阐明,人们把RNA干扰作为生物新技术应用到基础和临床研究。siRNA、质粒、病毒编码的shRNA作为一种常规化的试剂已经被纳入生物学家的“工具箱”中,用以下调目的基因转录后的表达。早前成功的报道在小鼠模型中体内RNA干扰人的致病基因[43]。未来RNA干扰技术应用将会使高通量筛选多重siRNAs成为可能。

从最初的脂质体到生物病毒再到高分子纳米材料,我们阐述了不同的RNA干扰载体的特性。尤其是碳纳米管、硅纳米管,不仅可以作为核酸的转运载体甚至可以携带药物用于疾病治疗,然而这些纳米材料的生物相容性是亟待解决的问题。人们通过偶联不同的生物活性分子或功能化修饰使碳纳米管微观结构、溶解性、穿透力及生物相容性得到很大的改善。

RNA干扰不仅推动了后基因组时代的发展,在发现疾病相关基因、疾病治疗和药物筛选研发方面也起到了积极的作用。用RNA干扰制备药物,其思路是根据病原体如病毒、细菌等的致病基因序列,以及生物体内与疾病发生相关的基因序列,设计和制备与这些基因序列同源的双链RNA。再将这些RNA转入动植物内使有关的疾病基因靶向“沉默”,从而达到治疗疾病的效果。目前的主要问题是找到一种高效低毒用于人体的转运载体,它既能携带靶基因siRNA,又不引起人体免疫反应。尽管如此,人们依然可以预测与其他基因技术一样,siRNA与RNA干扰技术将在不久的将来会在基因治疗和基因应用中发挥极大的作用,并将给整个生物理论带来巨大而深远的影响。

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[43]Yokota T, Sakamoto N, Enomoto N, et al. Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived small interfering RNAs[J]. Embo Reports, 2003, 4(6):602-608.

(责任编辑 狄艳红)

Research Progress of Gene Silencing by RNA Interfering Technology in Mammal

Cao Tengwei1Gu Lingyun2Huang He1,3Gao Zhen1Li Mingfang4
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816;2. Jiangyin Hospital Affiliated to Southeast University,Jiangyin 214400;3. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,Nanjing 210009;4. The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029)

Variation of metabolic pathways result from RNA interference and related RNA silencing pathways have revolutionized our understanding of gene regulation. Gene silencing has been used as a research tool to control the expression of specific genes in numerous experimental organisms. Importing the different cells with specific siRNA need different transfection reagent to achieve maximum transfection efficiency, and will not produce larger cell toxicity. In recent years, new nano-material such as carbon nanotubes exert interference effect expanding us the traditional liposomes and virus’ understanding. The rapid progress in the field of RNA interference was summarized, and then compare different RNA interference experiments used several different carriers. Further, the perspectives of future research on RNA interference mediated from traditional liposomes to virus and polymer nano-material in disease treatment and clinic diagnose were proposed.

RNA interference Small interfering RNA Gene silencing Transfection Carbon nanotubes

2014-01-20

国家自然科学基金项目(81000083)

曹腾威,男,硕士研究生,研究方向:分子细胞学;E-mail:caotw6154@163.com

高振,男,博士,副研究员,研究方向:生物化学;E-mail:gaozhen@njtech.edu.cn郦明芳,女,博士,讲师,研究方向:心脏电生理学;E-mail:mingflee@hotmail.com

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