家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

赵学军 国果 吴沁怡 陶如玉 吴建伟

（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

赵学军 国果 吴沁怡 陶如玉 吴建伟

（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1（MD-TCPⅠ）基因进行序列分析，克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCP Ⅰ基因，对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板，通过PCR的方法进行扩增，以pET-28a（+）为载体构建重组质粒，再转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示，MD-TCP Ⅰ基因ORF全长753 bp，编码250个氨基酸，理论分子量27.07 kD；等电点5.92，该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCP Ⅰ重组表达质粒，重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。

家蝇 TCP 序列分析 基因克隆 表达

伴侣蛋白是一大类在生物大分子折叠、组装及降解过程中起着重要的协同作用，但自身并不发生任何变化的存在于生物体内的蛋白质分子［1］。热休克蛋白60（HSP60）是HSPs类分子伴侣，是一种与细胞应激损伤关系密切的蛋白质，广泛存在于原核及真核细胞中。HSP60在正常细胞中表达很低，但是在高温、缺氧、感染、创伤等因素刺激下表达增强，对提高细胞耐受应激的能力，维持细胞内环境的稳定具有重要作用［2］。TCP属于HSP60家族，是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白，也是迄今为止真核细胞胞浆中发现的唯一一个伴侣素［3］。研究发现正常条件下，HSP60以稳定状态存在于细胞质

和线粒体基质中；应激条件下，HSP60 迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白［4］，并且TCP能与蛋白因子结合形成目标蛋白［5］。

家蝇Musca domesitca是世界性广泛分布的卫生昆虫，从幼虫到成虫均生活在肮脏的环境中，表现出较强的环境适应能力，所以家蝇必然具有完善而高效的免疫防御机制，我们对此产生了极大的兴趣。目前对家蝇热休克蛋白的研究报道主要是热休克蛋白70［6］和小分子量热休克蛋白［7］，对其TCP蛋白的研究尚未见报道。本研究克隆MD-TCPⅠ基因，并对其序列进行生物信息学的分析，同时建立MD-TCPⅠ体外表达系统，旨在为进一步研究MDTCPⅠ特性和有效利用功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 文库、菌种及质粒 家蝇3龄幼虫全长cDNA质粒文库的构建和EST测序及Unigene 分析由北京华大合作完成。原核表达质粒pET-28a（+）和大肠杆菌BL21（DE3）由中山大学引进本实验室保存。

1.1.2 主要试剂及工具酶 Ex Taq酶（含dNTP），EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶，DNA 标准（DL 2 000 Marker）均购自大连宝生物工程公司；异丙硫代β-D半乳糖苷（IPTG）购自美国Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京鼎国生物。

1.1.3 引物合成和DNA测序 基因扩增引物合成由Invitrogen上海生物技术有限公司完成，重组质粒DNA测序上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蝇TCP基因Ⅰ（MD-TCPⅠ）的识别及序列测定 对测定得到的家蝇3龄幼虫EST序列进行Blastx分析，从中筛选获得编码家蝇TCPⅠ基因的文库质粒（编号为004-E08），命名为MD-TCPⅠ。

1.2.2 MD-TCPⅠ基因的生物信息学分析 利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（Expert protein analysis system，ExPASy）提供的生物信息学工具，分析预测蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。

1.2.3 MD-TCPⅠ基因的扩增 根据已获得的MDTCPⅠ编码序列，利用DNA Club和Primer5.0设计引物。上游引物：5'-GCGGAATTCATGGCTTCAATT AGTTTATTGAATC-3'（下划线为EcoRⅠ酶切位点）；下游引物：5'-CCGAAGCTTTTATAGAAGAAACCCAG AGTT-3'（下划线为Hind Ⅲ酶切位点）。

以家蝇3龄幼虫cDNA文库中MD-TCPⅠ基因的质粒为模板，PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收。

1.2.4 重组原核表达质粒（pET-28a（+）-MD-TCPⅠ）的构建及鉴定 将PCR产物和原核表达质粒pET 28a（+）经EcoRⅠ、HindⅢ 双酶切后回收，连接并转化大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆，对阳性克隆提取质粒进行PCR，双酶切和测序鉴定。

1.2.5 MD-TCPⅠ基因在大肠杆菌BL21/DE3中的诱导表达 取1 mL培养过夜的阳性克隆菌液，加入含有卡那霉素的100 mL LB培养基中（菌液/培养基为1/100），37℃ 220 r/min振摇至OD600=0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度4 mmol/L，诱导表达6 h。离心收集菌体，进行超声破碎。超声破碎沉淀和上清各自取20 μL，各加入50 μL 1×SDS- PAGE上样缓冲液，煮沸5 min，13 000 r/min离心1 min，取沉淀和上清5 μL进行SDS -PAGE电泳分析。

2 结果

2.1 序列分析

MD-TCPⅠ基因与葱蝇的同源基因氨基酸序列的一致性可达89%，ORF全长753 bp，编码250个氨基酸（图1），预测分子量为27.07 kD，理论等电点（pI值）5.92。Inter ProScan 分析显示其具有TCP-1家族的氨基酸保守结构域（图2）。

信号肽预测 将MD-TCPⅠ氨基酸序列在丹麦技术大学生物序列分析中心（CBS）的网站（http：//www. cbs.dtu.dk/servies/SingnaIP/）进行在线分析，结果显示，氨基酸序列无信号肽。

TMHMM（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0）预测MD-TCPⅠ基因无跨膜区。

图1 MD-TCPⅠ开放阅读框cDNA序列及对应编码的氨基酸序列

图2 MD-TCPⅠ结构域预测

利用SOPMA网站预测MD-TCPⅠ基因编码蛋

白的二级结构，发现其二级结构主要有4种类型，分别为α-螺旋占42.40%，β-折叠占7.20%，延伸链占21.60%，无规则卷曲占28.80%（图3）。利用ExPASy网站上提供的SWISS-MODEL对该基因的编码蛋白进行三级结构的预测，可清楚地看到该蛋白具有丰富的α-螺旋结构，延伸链和无规则卷曲也较明显（图4），从而验证了SOPMA网站对其二级结构的预测。

图3 MD-TCPⅠ二级结构分析结果

图4 MD-TCPⅠ的三级结构

2.2 MD-TCPⅠ基因扩增及原核重组质粒的鉴定

MD-TCPⅠ基因经PCR扩增后，获得了750 bp左右的特异条带（图5泳道1）。将重组质粒进行双酶切鉴定，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果（图5泳道3）显示，重组质粒双酶切后，在750 bp左右有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，提示重组质粒构建成功。将挑选的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司，进一步以pET-28a（+）的通用引物对重组质粒测序，结果表明相应的插入序列与目的基因cDNA序列一致，证明MD-TCPⅠ基因原核表达重组质粒构建成功。

图5 MD-TCPⅠ的克隆及酶切签定

2.3 目的基因表达产物的SDS-PAGE鉴定

取重组菌诱导前后的表达产物和超声破碎沉淀、上清进行SDS-PAGE，结果发现诱导的重组菌约在31 kD左右出现表达条带，与目的蛋白预测的分子量（27.07 kD）加上所带His标签分子量（约3 kD）基本相符，而未诱导菌无此条带。超声破细胞后显示该蛋白在包涵体大量表达箭头所指（图6）。

图6 重组质粒pET-28a（+）- MD-TCPⅠ在大肠杆菌的表达产物SDS-PAGE电泳分析

3 讨论

分子伴侣不仅使胞内蛋白折叠、组装与转运帮助蛋白［8］，还可以成为感染性疾病中的免疫优势抗原，激发宿主体内的体液免疫反应和细胞免疫反应，已经证实在细菌或寄生虫感染中具有免疫保护作用，表明分子伴侣有可能用作疫苗来抵抗微生物感染，或者用来治疗肿瘤和自身免疫性疾病［9］。分子伴侣与肿瘤有着密切的联系，在肿瘤发生中扮演着很重要的角色，既可以促进肿瘤细胞的自主增殖，又可以抑制细胞的凋亡［10］。食管癌的侵袭转移了能力与HSP27呈负相关，HSP27高表达的食管癌其侵袭转移能力受到抑制［11］。研究发现，TCP伴侣蛋白

是进化上最为保守的蛋白质之一，由“背靠背”堆叠的双环状亚基构成，每个环有8个不同的亚基［5］。TCP伴侣蛋白在肌动蛋白、微管蛋白的组装和折叠中发挥着重要的作用，TCP伴侣蛋白翻译机制中的促进其它蛋白正确折叠，为细胞环境如细胞信号介导、细胞增殖等密切关系提供了佐证［12］。TCP的异常会导致细胞骨架蛋白发生改变，甚至影响细胞骨架的形成与聚集［13］。葱蝇的蛹期冷驯化，TCP-1基因会明显的上调，使蛹对环境温度有更高的耐受性，增强昆虫的抗寒的能力［14］。对二化螟幼虫热胁迫时，可引起二化螟幼虫体内产生氧化应激反应，显著提高子幼虫血淋巴细胞内热休克蛋白水平［15］。CCT6A下调表达能显著抑制结肠肿瘤细胞的迁移和侵袭能力［16］。此外，TCP伴侣蛋白在视网膜感觉神经元的形成和生成扮演着重要的功能，是神经系统退行性病变的一个潜在的因素［17］。TCP伴侣蛋白在卵泡生长发育中也起着重要的作用［18］。

4 结论

将家蝇TCPⅠ基因片段克隆到原核表达载体pET-28a（+）中，构建重组质粒pET-28a（+）/ MD-TCPⅠ，获得的重组质粒经过酶切、PCR和测序鉴定，证实含有目的基因片段，重组质粒转化入大肠杆菌BL21/DE3，IPTG诱导表达，电泳显示重组蛋白条带清晰，表明重组蛋白得到了高效表达。

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（责任编辑 马鑫）

Sequence Analysis，Cloning and Induced Expression of Chaperonin Gene in Housefly（Musca domesitca）

Zhao Xuejun Guo Guo Wu Qinyi Tao Ruyu Wu Jianwei
（School of Basic Medical Sciences，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

The aim of this study is to analyze and predict the structural and characteristics of genes and encoding proteins of MD-TCPⅠ（Musca domesitca Chaperonin TCP- 1（MD-TCPⅠ））, with the methods of cloning and expressing that gene. Sequence analysis indicated that the open reading frame was 753 bp, encoding a putative protein consisting of 250-amino acids, which no signal sequence and NCBI-BLAST showed acid sequence identify with other insect TCP-1 were 89%. The protein, with a predicted molecular weight of 27.07 kD, and pI of 5.92, which acid sequence as tcp-1 belong to HSP60 family. The gene coding for MD-TCP Ⅰwas amplified by polymerase chain reaction（PCR）, and then was ligated into vector pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）competent cell, induced with IPTG. The fusion protein in the expression vector was analyzed by SDA-PAGE. The results indicated that the recombinant plasmid with the correct target gene was constructed, and the fusion protein was expressed in E. coli BL21（DE3）.

Musca domestic TCP Sequence analysis Gene cloning Express

2014-02-20

国家自然科学基金项目（81160204，81360254），贵州省科技厅基金项目（黔科合［2010］3160），高校博士点学科专项科研基金项目（20105215120001）

赵学军，男，硕士研究生，研究方向：医学寄生虫的分子免疫；E-mail：383657226@qq.com

国果，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：昆虫免疫；E-mail：guoguojsc@163.com