金川多肋牦牛HOXC10基因的克隆、序列分析及组织表达

张亚南熊显荣兰道亮符梅张雁侯定超马定美李善荣李键

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.金川县畜牧兽医局，金川 624100）

金川多肋牦牛HOXC10基因的克隆、序列分析及组织表达

张亚南1熊显荣1兰道亮1符梅1张雁1侯定超2马定美2李善荣2李键1

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.金川县畜牧兽医局，金川 624100）

旨在克隆牦牛HOXC10基因，并进一步分析该基因的结构与功能以及揭示其组织特异性表达规律。以金川多肋牦牛为材料，根据GenBank已公布的绵羊HOXC10基因序列设计引物，采用RT-PCR技术对HOXC10基因的cDNA全长进行扩增，并对其进行生物信息学分析及在各组织中的表达谱。对测序结果进行生物信息学分析表明，扩增的牦牛HOXC10基因长度是1 272 bp，其中包含一个1 029 bp的开放阅读框，共编码342个氨基酸；同源性分析表明，牦牛与黄牛的相似性较高，为93.2%；预测HOXC10蛋白质的分子量为38.2 kD，理论等电点为8.45；进化树分析显示，牦牛与黄牛的亲缘关系最近，处于同一个分支上；组织表达谱分析表明，该基因在牦牛各组织中均有不同程度的表达，其中在肝脏中的表达量最高，胃中的表达量最低。

牦牛 克隆 HOXC10 序列分析 组织表达

HOX基因（Homeobox）也被称为同源盒、同源框或同源异形基因，是一种调节动物胚胎发育的基因，并且在调控细胞的增殖分化方面也起着重要的作用，最早是由美国科学家Lewis利用果蝇杂交互补的方法发现的HOX基因几乎存在于所有的两侧对称的动物体内，并且其调控机理很相似，HOX家族是指成簇存在的同源异形盒基因，基因间的同源性比率在70%-80%，该家族所编码的蛋白质均含

有由61个氨基酸组成的同源结构域（homeodomeo，HD）［1］。目前，根据基因在染色体上的分布、序列的同源性及表达蛋白结构的不同，可将其分为两类，一类HOX基因可以分为A、B、C和D 4个基因簇，串联分布于7、17、1和2号染色体上；另一类HOX基因，又称non-HOX基因，由多个散布于不同染色体的基因家族构成，如TALE、CDX、PAX等［2］。HOXC10是HOX基因家族中重要的一员，目前已经有研究表明，HOXC10不但影响脊椎动物的胚胎发育，更重要的是影响神经系统的发育［3］，同时也对脊椎动物的断肢及尾部的再生过程有一定的影响［4］。

牦牛主要分布于我国青藏高原地区，约占世界牦牛总数的95%［5，6］，常生活在于海拔3 000 m以上，能充分利用高寒草地牧草资源，对高寒草地的生态环境具有极强的适应性，为当地牧民提供生产和生活必需品，是青藏高原地区牧民的重要生活和经济来源。在长期的自然选择和人工选择的共同作用下，牦牛对高海拔、低温、低氧牧区具有良好适应性，能利用高寒草场资源带来优质、安全、营养的绿色食品［7］。Tserang等［8］在四川金川县牦牛群体调查统计中发现，多肋牦牛的个体占群体总数的52 %，并且该多肋牦牛群体的繁殖率和生产性能都明显比非多肋牦牛的偏高。

目前，对于HOXC10在牦牛上的研究还很少，主要集中在其影响动物体轴发育、肢体调控方面［9］。鉴于HOX基因是动物躯干发育的框架设计基因，对DNA的合成和转录起关键性作用，每个HOX基因都有特定的表达域，共同调控机体发育［10］。本研究通过对金川多肋牦牛HOXC10克隆，对其基因序列进行生物学分析，旨在为下一步解释该基因对牦牛生长发育及胚胎骨骼发育等的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

牦牛组织样品，采自四川省阿坝州金川县的多肋牦牛。液氮保存带回实验室，-80℃保存备用。Trizol试剂购自Invitrogen（上海）公司，反转录酶试剂盒购自Ferments公司；Taq DNA聚合酶购自天根生化科技有限公司；DNA片段凝胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司；pMD19-T克隆载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol法提取牦牛心、肝、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉、乳腺、卵巢、子宫、输卵管的总RNA，并用Nanodrop ND-1000（LabTech，USA）检测RNA的浓度和质量，-80℃保存备用。按照Ferments公司的反转录酶说明书，采用20 μL体系：1 μL Oligo（dT）18primer，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor（20 g/L）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase（200 g/L）1 μL，模板2 μg，最后用无RNA酶水补足至20 μL，反转录程序：42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成第一链cDNA，-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank中绵羊（登录号为XM_004006284.1）HOXC10基因的CDS区序列，采用Premier Premier 5.0软件设计一对PCR引物：MF1：5'-CCTCCGCTGTAGTATTGCTC-3'，MR1：5'-GAAGATGCGTCCACCTAAAG-3'，所处位置分别为71-91、1 322-1 342，预期产物长度1 272 bp，退火温度为55℃，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.3 目的基因的克隆 以牦牛卵巢组织cDNA为模板，引物为HOXC10的F、R，PCR扩增体系为25 μL，反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，用Axygen的凝胶回收试剂盒回收纯化的PCR产物，取适量纯化的PCR产物与克隆载体pMD19-T进行连接，转化DH5α感受态细胞并在Amp+的琼脂平板上涂菌。挑取单个菌落连接于含Amp+的LB液体培养基。经过PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen（上海）公司进行测序。

1.2.4 目的基因序列分析 扩增的牦牛HOXC10基因编码区序列，采用ORF Finder在线程序预测开放阅读框；利用ExPASy网站的在线工具Protparam和ProtScale分析牦牛HOXC10基因编码蛋白质的基本理化性质和疏水性质；利用Interpro在线预测网站预测蛋白质的结构域和功能位点；利用DNAstar软件对克隆得到的牦牛HOXC10编码区与NCBI基因

库中绵羊、黑猩猩等其他动物进行同源性比对，并用MEGA软件进行进化树分析。

2 结果

2.1 目的基因的扩增

以牦牛卵巢组织为模板，克隆得到了HOXC10基因。结果（图1）显示，扩增片段大小在1 270 bp左右，与预测扩增片段大小基本相符，初步证明克隆成功。分析发现该序列包含一个1 029 bp的开放阅读框，预测的蛋白质分子量约为 38.2 kD，该蛋白序列中含有43个带有负电的氨基酸残基，47个氨基酸带有正电荷正电荷，理论等电点是8.45。

图1 金川多肋牦牛HOXC10基因的扩增结果

2.2 HOXC10基因的组织表达分析

以金川多肋牦牛的肝脏、子宫、小肠、输卵管、肺脏、大肠、乳腺、胃、肌肉、卵巢、心脏、肾脏组织为材料，提取总RNA，通过RT-PCR方法检测HOXC10在不同组织中表达量。结果表明，在金川多肋牦牛的12个组织中均有HOXC10基因的表达，其中在肝脏、子宫、小肠中的表达量相对较高，在输卵管、胃、肌肉中的表达量相对较低（图2）。

图2 HOXC10基因的组织表达谱

2.3 蛋白质结构和功能预测

2.3.1 牦牛HOXC10基因编码蛋白结构域和功能位点预测 利用Interpro在线工具对牦牛HOXC10基因编码蛋白进行结构域预测，结果（图3）表明，该序列在第241-330位氨基酸之间具有完整的DNA-binding domain功能域。

2.3.2 牦牛HOXC10基因编码蛋白质亲水性/疏水性分析 运用ExPASy中的ProScale子程序对HOXC10的亲疏水性进行分析。结果（图4）显示，根据氨基酸亲水性/疏水性规律分析，分值越低的亲水性越强，分值越高的疏水性越强。由图4可以看出，牦牛HOXC10的C端0-50个氨基酸区域处有一个明显的疏水区域，最大值为1.06（第45位氨基酸），最小值为-2.5（第230位氨基酸），在40-50位氨基酸区域很可能是HOXC10蛋白的跨膜区域。

2.3.3 牦牛HOXC10蛋白分子跨膜区预测 利用在线分析程序TMpred对HOXC10蛋白质跨膜区进行预测，结果（图5）显示，该蛋白在0-50个氨基酸处有一个典型跨膜区段，结合亲/疏水性的预测结果，可以判定此处是HOXC10蛋白的跨膜区域。

图3 HOXC10蛋白质功能结构域分析

2.4 金川多肋牦牛HOXC10同源性分析

利用DNAStar软件程序MegAlign的Clustal W方法与GenBank公布的部分物种HOXC10基因进行同源性比较。结果（图6）显示，牦牛与黄牛、绵羊、猫、野猪、人同源性较高，分别为93.2%、97.8%、97.9%、96.1%和95.5%，与原鸡、爪蟾的同源性较低，分别为68.7%和63.3%，说明牦牛HOXC10基因在长期进化中较为保守，尤其在哺乳动物间具有较高保守性。

2.5 牦牛HOXC10的系统进化分析

用MEGA.5软件的Neighbor-Joining法，将获得的11条HOXC10基因序列构建Btstrap的系统发育树，结果（图7）显示，牦牛与黄牛的亲缘关系最近，并与家绵羊、野猪、猫、马、人、黑猩猩、家鼠形

成哺乳动物的一个分支，与原鸡和爪蟾形成一个与牦牛较远的分支。

图4 HOXC10蛋白质的亲疏水性分析

图5 HOXC10蛋白质跨膜区分析

图6 金川多肋牦牛HOXC10基因的同源性分析

3 讨论

同源盒（Homeobox）基因是一类在胚胎发育、细胞分化转录过程中的主控基因，含有共同的183个核苷酸序列（同源盒）编码转录因子的调节基因［11］，这些基因在生物进化中具有高度的保守性，暗示了它们在生物发育过程中扮演着重要角色。研究发现脊椎动物HOX基因簇随着基因组的两次复制产生4个HOX基因簇，首先是由HOXA复制出HOXB，再由这两个簇复制出HOXC和HOXD，因此，人和哺乳类具有4个连锁群，分别命名为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD，这4个连锁群分别位于4条染色体上，每个连锁群具有大约13个HOX基因［12］。其中，HOX1-3主要在头部枕骨区表达，HOX4-6在颈椎区表达（包括第一胸椎），HOX7-9在胸腰区高表达，HOX10-11在腰荐区表达，HOX12-13表达于荐尾区［13］。脊椎动物HOX基因主要在于调控胚胎前后体轴和体节的分化。作为HOX家族的一员，HOXC10基因被证明与动物体节最后的发育存在紧密的联系［14］，即控制着成骨细胞的分化、骨骼发生及肢体的发育。

图7 基于HOXC10基因序列构建的牦牛与其他物种的系统进化树

目前，HOX基因是一个比较热门的研究领域，对HOX的研究主要集中在胚胎及骨骼发育方面，但在各组织中的表达和功能关系还未做深入研究［15］。而HOX基因的突变和异常将会使他所调控的区域发生畸形［16］。本试验成功克隆了HOXC10基因并对其进行生物信息学分析，初步分析了金川多肋牦牛HOXC10基因所编码的蛋白质的结构和功能，为下一步探究HOXC10在调控多肋牦牛肋骨发育上的功能奠定了理论基础。基因同源性比对结果显示多肋牦牛HOXC10基因与其它物种具有较高的同源性，暗示了HOXC10基因在调控动物发育过程中的重要性；另外，本试验成功分析了HOXC10基因的表达

谱，组织表达分析结果表明HOXC10在牦牛大部分组织中都有表达，尤其在肝脏、子宫中的表达量较高，这与小鼠胚胎中表达谱结果基本一致［17］。基因在不同组织中的表达量水平直接与其功能相关［18］，HOXC10基因在组织中的差异表达与功能的关联分析将是下一步研究的重点内容。此外，由于环境的显著差异性，推测基因的差异很可能存在于基因编码区以外的区域，如启动子区域的甲基化水平的程度往往会导致基因表达量的差异。

基于以上的研究结果，初步推测在金川多肋牦牛体节发育过程中，HOXC10可能有重要的调控作用。当然，该基因的功能有待在已建立的牦牛的乳腺上皮细胞系上进行验证［19］。后续试验将对多肋与非多肋牦牛各主要器官HOXC10基因表达量进行定量分析，以确定HOXC10基因的表达是否存在明显差异性，为探索HOXC10基因的更多的分子机制提供更有力的依据。

4 结论

本试验克隆的牦牛HOXC10基因包含一个1 029 bp的开放阅读框，编码342个氨基酸；该基因所编码的蛋白属于亲水性蛋白质；牦牛与其它物种的HOXC10基因编码区序列具有较高的同源性，该基因在生物进化上高度保守；进化结果显示，牦牛与黄牛的亲缘关系最近。本研究分析序列和蛋白时，选用多种软件，提高了结果的可靠性。

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（责任编辑 马鑫）

Cloning，Sequence and Tissue Expression Pattern Analysis of HOXC10 Gene in Multi-costa Properties Yaks of Jinchuan

Zhang Yanan1Xiong Xianrong1Lan Daoliang1Fu Mei1Zhang Yan1Hou Dingchao2Ma Dingmei2Li Shanrong2Li Jian1
（1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041；2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Jinchuan County, Jinchuan 624100）

The present study aimed at cloning yak HOXC10 gene, and further analysis of the gene structure and function, and reveals the tissue specificity expression pattern. The Jinchuan multi-costa properties yak as materials, this study based on the GenBank published Ovis aries HOXC10 gene sequences for primier designing, using RT-PCR technology to amplification the cDNA full length of HOXC10 gene, and its bioinformatic analysis and expression profiling in various tissues. The sequencing result showed that the length of yak HOXC10 gene is 1 272 bp and contains a 1 029 bp open reading frame（ORF）, encoding 342 amino acids. The results of homology analysis showed that yak and bos taurus has the higher similarity（93.2%）；Followed by predicting HOXC10 protein molecular weight 38.2 kD, the theory of isoelectric point is 8.45. Evolutionary tree analysis results showed that yak was closest relative with bos taurus, and in the same branch. Tissue expression profile analysis showed that HOXC10 gene is expressed in different degrees in various organizations, which had the highest expression in the liver, the lowest expression in the stomach.

Yak Cloning HOXC10 Sequence analysis Tissue expression

2014-04-22

国家科技支撑计划（2012BAD13B06），国家公益性行业(农业)科研专项（201203009），西南民族大学研究生创新性项目（CX-2014SZ72）

张亚南，女，硕士研究生，研究方向：细胞与胚胎工程；E-mail：yanan599302927@126.com

李键，男，博士，教授，研究方向：动物生殖调控；E-mail：lijian@swun.cn