真菌蛋白激发子PevD1互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达

唐小丽 伍文宪 韩磊 杨秀芬

（中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100081）

真菌蛋白激发子PevD1互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达

唐小丽 伍文宪 韩磊 杨秀芬

（中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100081）

PevD1是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）发酵液中分离纯化的一种新蛋白激发子，能激发烟草和棉花的免疫防御反应，提高抗病性。旨在深入研究PevD1的作用机理，利用酵母双杂交系统，以PevD1为诱饵蛋白，筛选拟南芥中PevD1的互作蛋白，经复筛、回转验证得到3个候选互作蛋白基因R1，R2和R4。利用同源克隆技术获得烟草中互作蛋白编码基因NR1、NR2和NR4；经酵母双杂交验证其中的NR2蛋白能与PevD1特异性结合。利用原核表达系统，成功构建了重组表达载体pMAL-C2XNR2并转化大肠杆菌细胞，经IPTG诱导获得了可溶性表达的NR2融合蛋白。

蛋白激发子 互作蛋白 酵母双杂交 原核表达

蛋白激发子能激活植物免疫系统，诱导植物广谱抗性，成为现代植物保护新的研究方向。蛋白激发子激发植物防御反应主要包括植物对激发子的识别（与植物靶标结合）、信号传导以及防卫基因表达调控等［1-3］，其中与植物靶标结合是蛋白激发子诱导植物抗性的开关［4，5］，也是揭示激发子诱导植物抗性机制的关键。尽管已经分离了众多的微生物激发子（效应子），但只鉴定了少数激发子的靶标，主要是寡糖激发子和细菌、卵菌激发子，其中研究比较清楚的是细菌鞭毛效应蛋白flg22的受体FLS2和延伸因子Tu（Elongation factor Tu，EF-Tu）的受体EFR［6-8］。细菌激发子（效应子）通过分泌通道进入植物并与植物靶标蛋白互作，但目前真菌效应子（激发子）进入植物细胞的分子机制尚不清楚，而且这些激发子与植物互作蛋白的研究也比较缓慢。

PevD1是本实验室从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）发酵液中分离到的一个新蛋白激发子，前期研究证明，该蛋白激发子能够激活烟草早期防御

信号事件的发生（叶片H2O2的积累、细胞活性氧的爆发、胞外碱化以及NO的产生和积累）；引起防御物质（胼胝质、酚类和木质素）的产生和积累；诱导烟草叶片的苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）等防御酶活性的提高，激发烟草产生系统获得抗性（Systemic aquired resistance，SAR）［9，10］。但烟草如何识别PevD1而激发烟草抗病反应目前尚不清楚。本研究用酵母双杂交系统筛选PevD1互作蛋白，利用植物识别激发子的蛋白序列具有保守性的特点，同源克隆PevD1在烟草中的互作蛋白，同时建立该互作蛋白的大肠杆菌表达体系，以期为深入研究PevD的功能以及二者在植物细胞体内和体外结合验证研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三生烟（Nicotiana tabacum var. Sumsun NN）种子由本实验室保藏。酵母双杂交系统中的拟南芥cDNA文库，酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）Y2H-gold，pGADT7（AD）和pGBKT7（BD）质粒，培养基：SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-Trp/-Leu（DDO），SD/-His/-Trp/-Leu（TDO），SD/Ade/-His/-Trp/-Leu（QDO），SD/Ade/-His/-Trp/-Leu/x-α-gal等购于Clontech公司。大肠杆菌感受态Trans5α购自北京全式金公司；原核表达载体pMAL-C2X由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 诱饵载体的构建 质粒提取、双酶切、连接及转化等参照试剂说明书和相关的分子生物学方法手册［10］。简要操作步骤如下：PCR扩增得到PevD1全长序列，将PevD1全长序列和提取的BD载体进行双酶切，再连接形成BD-PevD1重组载体，在ADH1启动子驱动下表达GAL4 BD-PevD1的融合蛋白并测序验证。

1.2.2 诱饵蛋白PevD1在酵母细胞中的表达及自激活的检测 采用PEG/LiAc法将上述构建的BD-PevD1载体转化酵母Y2HGold，然后用菌落PCR和Western blot检测验证PevD1在酵母细胞中的表达。虽然PevD1是一个真菌激发子，在酵母细胞中也具有潜在的激活基因转录的活性，所以在进行酵母双杂交试验前，先检测BD-PevD1能否自激活双杂交宿主菌Y2Hgold的报告基因。将分别转化BD-PevD1+ AD和BD+AD组合质粒的酵母细胞涂于DDO和QDO平板，30℃倒置培养3 d，观察酵母菌的生长情况。

1.2.3 PevD1在拟南芥中互作蛋白的筛选 将转入BD-PevD1的酵母悬浮细胞（浓度大于1×108个细胞/mL）5 mL与1 mL文库细胞混合，加入含有50 μg/mL的卡那霉素培养基中培养20-24 h（30℃，30-50 r/min）。1 000 r/min离心10 min，收集菌体，然后用10 mL 0.5×YPDA重悬。取细胞悬浮液200 μL涂于TDO和QDO平板（共50-55个），30℃，倒置培养3-8 d。在QDO平板上得到的阳性克隆，再划线于QDO+X-α-Gal平板，30℃恒温培养3-5 d观察是否变蓝［11］。排除明显的假阳性克隆后，用酵母PCR检测试剂盒进行菌落PCR，琼脂糖电泳分离后进行胶回收、测序。通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中的BLAST进行同源性比较，剔除非编码序列及移码蛋白，以确认与PevD1相互作用的候选蛋白。

1.2.4 酵母双杂交阳性克隆的鉴定 将从文库中筛选到的阳性克隆连接到诱饵载体BD上，同时将PevD1克隆到AD载体上，然后将两种质粒共转化酵母细胞Y2Hgold。将共转酵母细胞涂于DDO和QDO平板，30℃，恒温培养3-5 d。在QDO平板上生长的菌落，划线于QDO+x-α-gal平板，30℃恒温培养3-5 d观察是否变蓝［12］。

1.2.5 PevD1在烟草中互作蛋白基因的同源克隆在NCBI数据库中查找与R1、R2和R4同源的烟草基因序列NR1、NR2和NR4，用植物组织RNA提取试剂盒（北京全式金公司）提取三生烟总RNA，取2 μg mRNA用于cDNA第一链的合成（具体方法参见北京全式金公司反转录试剂盒说明书）。根据从数据库中获得的NR1、NR2和NR4基因序列设计特异引物，通过PCR扩增目的基因：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。目的条带经胶回收纯化后连接到pMD18-T载体中，转化至大肠杆菌感受态细胞Trans5α，由北京华大公司完成测序。

1.2.6 互作蛋白NR2的原核表达 提取原核表达载体pMAL-C2X以及测序正确的pMD18-T-NR2质粒，

用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切并回收载体片段及目的基因片段，22℃连接15 min后转化至表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中，28℃过夜培养，待长出单菌落，以单菌落为模板进行菌落PCR，筛选出阳性转化子后送公司测序。挑取pMAL-C2XNR2和pMAL-C2X空载体的单菌落，分别接种于50 mL含Amp（终浓度为100 μg/mL）的液体LB培养基中，37℃，220 r/m振荡培养6-7 h，再按1∶100的比例稀释到1 L含Amp（100 μg/mL）新鲜液体LB培养基中，37℃，220 r/min振荡培养4 h，温度调至16℃，转速调至200 r/min，待温度降至16℃后，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导培养过夜，次日将菌液分别移入离心管中，4℃，5 000 r/min 离心15 min，弃上清，然后用40-50 mL pH8.0的Tris缓冲液重悬沉淀菌体，超声破碎后的破碎液12 000 r/min离心50 min，取上清，将上清液先后通过麦芽糖结合蛋白亲和层析和镍柱亲和层析进行纯化，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。

2 结果

2.1 诱饵载体构建与鉴定

PCR扩增PevD1基因全长为468 bp，构建含BD结构域的诱饵载体BD-PevD1，形成在ADH1启动子驱动下表达的GAL4 BD-PevD1融合蛋白。融合蛋白表达载体转化酵母细胞后，通过菌液PCR 鉴定证明，PevD1已经转入酵母细胞中（图1-A），用PCR鉴定的阳性克隆培养液进行Western blot分析，结果（图1-B）显示，PevD1在酵母中能正确地表达。

图1 PevD1基因在酵母细胞Y2Hgold中的表达鉴定

2.2 诱饵蛋白PevD1的自激活检测

共转BD+AD和BD-PevD1+AD组合质粒的酵母菌均能在DDO平板上正常生长，菌落直径一般都＞2 mm，说明该组合质粒均成功转入，而且BD-PevD1表达的融合蛋白对Y2Hgold 酵母细胞生长无毒性、无抑制作用。转化BD-PevD1的酵母细胞在QDO平板未生长，说明诱饵载体BD-PevD1自身不具有转录激活活性，可进行PevD1互作蛋白筛选（图2）。

图2 诱饵蛋白PevD1的自激活检测

2.3 酵母双杂交筛选PevD1拟南芥中互作蛋白

通过多次筛选，在QDO平板上得到108个阳性结果（菌落＞3 mm），再次将菌落划线于QDO+X-α-Gal平板培养3 d后菌落变蓝的为阳性。提取阳性克隆质粒并进行测序，将测序结果在拟南芥基因库进行序列比对，经过对测序的108个克隆分析，剔除一些假阳性结果，从中挑选15个与植物的发育、凋亡、抗逆、抗菌的相关基因克隆到BD载体，同时将PevD1基因克隆到AD载体，进行酵母双杂交的回转验证，最终得到4个阳性结果（图3），其中两个基因与植物的发育与死亡相关（分别命名为R1，R2），一个与细胞凋亡调节相关（R3），另一个与植物的抗菌相关（R4）。但其中转有R1、R2和R4基因的转化子在加有X-α-Gal的QDO平板上生长非常旺盛（图3-1，3-2，3-4），而且均在2-3 d变蓝。而图3-3显示，R3在加有x-α-gal的QDO平板上生长较弱，而且变蓝需要时间长。所以最终确定R1、R2和R4为PevD1在拟南芥中的候选互作蛋白。

2.4 PevD1候选互作蛋白基因的同源克隆

通过PCR扩增获得三生烟中的3个候选互作蛋

白基因，分别命名NR1（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-115714）、NR2（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-64-888）和NR4（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-29571），大小为891、951和774 bp。在NCBI数据库比对，NR1、NR2和NR4与拟南芥同源基因的氨基酸序列一致性分别达到68.98%、51.27%和40.84%。

图3 酵母双杂交筛选拟南芥cDNA文库互作蛋白

图4 烟草同源基因NR1、NR2和NR4的克隆

2.5 烟草中PevD1候选互作蛋白的酵母双杂交验证

利用上述的酵母双杂交系统，将3个候选互作蛋白基因构建到AD载体并与上述已构建的BDPevD1载体共转酵母细胞进行验证，结果（图5-1，5-2）表明组合质粒已成功共转入酵母细胞，其中AD-NR1+BD、AD-NR2+BD和AD-NR4+BD转化子在QDO平板上不生长，说明这3个蛋白均无自激活活性（图5-3）。能在加入AbA和X-α-Gal的QDO培养基上生长且在2-3 d之内形成菌落的只有ADNR2+BD-PevD1转化子（图5-4），说明只有NR2 与PevD1 特异性结合。

图5 PevD1在烟草中候选互作蛋白酵母双杂交验证

2.6 候选互作蛋白NR2生物信息学分析

通过SMART在线预测蛋白二级结构软件预测分析，NR2含有335个氨基酸残基，在N端1-199 aa形成4个低复杂区域，在C 端有一段包含130 aa的非常保守的氨基酸序列，命名为生长发育与细胞死亡（Development and cell death，DCD）结构域。根据预测DCD功能结构域在蛋白中的位置，NbR2属于含DCD结构域蛋白家族的I亚组，目前已报道的有 4类蛋白，包括B2 蛋白、Gda1 蛋白、天门冬酰胺丰富蛋白（N-rich protein，NRP）和GDA2蛋白（AJ491856.1）。这些蛋白与植物发育、细胞死亡、植物对病原菌和非生物胁迫的早期反应均有直接或者间接的关系。系统发育树（图6）显示，NR2与胡萝卜的B2蛋白和大豆的N-rich 蛋白聚类为一类。推测NR2可能与B2和N-rich蛋白具有相似的功能。

图6 通过邻接法构建的 NR2与包含DCD结构域的蛋白构建的系统发育树

2.7 候选互作蛋白的原核表达

为了进一步研究候选互作蛋白的功能，需要获得可溶性表达的蛋白。通过原核表达载体的筛选，pMAL-C2X适于NR2蛋白表达，该表达载体可以提高目标蛋白的可溶性。为了便于表达蛋白的纯化，设计引物时在蛋白的C端引入6个组氨酸密码子的HIS标签。将构建的重组原核表达载体pMALC2X-NR2和空白对照质粒pMAL-C2X分别转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后SDS-PAGE凝胶电泳检测，目标蛋白可以可溶性表达。由于所克隆的NR2基因为951 bp，其编码蛋白分子量约为38 kD，pMAL-C2X上的MBP标签蛋白为40 kD，因此pMAL-C2X-NR2融合蛋白的分子量约为78 kD。SDSPAGE（图7）分析显示，与pMAL-C2X空载体表达产物相比，在70 kD左右多了一条比较明显的蛋白条带。将pMAL-C2X-NR2破碎的菌液经过镍柱和麦芽糖结合蛋白亲和层析之后得到单一的蛋白条带，分子量为78 kD左右。说明pMAL-C2X-NR2在大肠杆菌中成功表达，经过亲和层析纯化，得到了纯化的融合表达蛋白。

图7 pMAL-C2X-NR2原核表达和纯化SDS-PAGE电泳分析

3 讨论

植物在长期抵御生物和非生物逆境因子过程中逐渐形成了先天免疫系统，该系统包含复杂的识别机制，使植物通过感知“非我”分子来启动防卫反应抵抗外来入侵者［13］。植物与病原真菌互作是通过激发子或效应子来实现的，植物细胞接受微生物产生的激发子，通过特有的信号传导途径，调控防御基因的表达和防御物质的形成，使植物获得免疫特性。基于蛋白质的相互作用来研究蛋白激发子与植物互作机理是当前植物病理学的热点领域，也是揭示激发子诱导植物抗性机制的重要基础，对人类有效控制植物病害具有非常重要的指导作用［14］。

许多植物可以通过程序性细胞死亡或称过敏反应（Hypersensitive response，HR）的形式识别病原微生物或其产生的激发子。死亡细胞产生信号激发植物免疫系统，使受刺激的周围细胞乃至整株植株产生防卫反应以限制病原微生物的扩展［15］。本研究的蛋白激发子PevD1是大丽轮枝菌分泌蛋白，引起烟草的HR、激发烟草免疫反应，而HR反应之后的免疫分子机制尚不清楚。NR2属于含DCD结构域蛋白家族的I亚组，该家族蛋白参与植物发育、细胞死亡、植物对病原菌和非生物胁迫的早期反应等，但NR2在烟草中的功能尚未见报道。本研究用酵母双杂交系统筛选并验证获得了蛋白激发子PevD1互作蛋白NR2，该蛋白含有非常保守的DCD结构域。2001年Ludwig和Tenhaken［16］首次发现了大豆HR反应强烈诱导了含DCD结构域的天门冬酰胺丰富蛋白（N-rich protein，NRP），其定位于细胞壁［16］，此后又陆续发现了胡萝卜B2 蛋白［17］，豌豆Gda1蛋白［18］都包含DCD结构域。DCD是一个约130个氨基酸的长链，包含了几个保守的基序，如N端的FGLP和 LFL基序、C端的 PAQV和PLxE基序。目前只在植物中发现了含有DCD结构域的蛋白，随着对该类蛋白研究的不断深入，已证明含有DCD结构域的蛋白参与由臭氧和病原菌引起的程序性植物细胞死亡、对病原菌刺激的早期反应以及抗逆反应等［16，18，19］。蛋白间的相互作用对于生物学功能的发挥是非常重要的，本研究利用酵母双杂交技术筛选出108个PevD1拟南芥文库的候选互作蛋白，通过理论分析和酵母双杂交回转验证，最终确定烟草NR2与PevD1特异结合。可以假设PevD1可能是通过识别烟草中的NR2后引起烟草的过敏反应，继而激发了一系列的信号传递通路，最终引起烟草对TMV的免疫反应，但这些假设需要今后深入探讨。

为了进一步验证NR2与PevD1的体外互作，需要获得可溶性的表达蛋白。本研究曾筛选多种表达

NR2的载体，但均未能得到理想的蛋白表达。原核表达载体pMAL-C2X能提高目标蛋白的可溶性，经诱导表达条件优化，获得了正确表达的可溶性蛋白，并通过在表达载体上加组氨酸标签和自身带有MBP标签进行亲和层析纯化得到了一定纯度和一定浓度的目的蛋白，为候选互作蛋白的功能研究和体外结合验证研究奠定了基础。

4 结论

本研究以蛋白激发子PevD1为诱饵蛋白，从拟南芥cDNA文库中筛选到R1、R2和R4三个互作蛋白。利用同源克隆技术获得了烟草中的3个同源基因，其蛋白分别命名为NR1、NR2和NR4。用酵母双杂交技术验证了只有NR2与PevD1特异性结合，确定了NR2是PevD1在烟草细胞中的结合蛋白。将NR2蛋白基因构建于原核表达载体pMAL-C2X上并转化大肠杆菌中，经诱导表达得到大量可溶性重组蛋白，通过麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签亲和层析技术获得了纯度较高、性质稳定的MBP-NR2融合表达蛋白。

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（责任编辑 马鑫）

Screening of Interacting Proteins with Fungal Elicitor PevD1 by Yeast Two Hybrid System and High Expression of Recombinant in E. coli

Tang Xiaoli Wu Wenxian Han Lei Yang Xiufen
（The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

PevD1, a fungal protein elicitor, was secreted from Verticillium dahliae and could induce hypersensitive responses（HR）and systemic acquired resistances（SAR）in tobacco plant. In this study, we screened its interaction partners using yeast two hybrid system with Arabidopsis thaliana cDNA library. Three potential interacting proteins were obtained. Homologous genes NR1, NR2 and NR4 in Nicotiana tobacum were cloned. Yeast two-hybrid binding assays confirmed NR2 protein strangely binding with PevD1. The entire coding region of NR2 gene was cloned into the bacterial expression vectors pMAL-C2X. After IPTG induction and SDS-PAGE analysis showed that the target protein was expressed at a high level in bacterial cells.

Fungal elicitor PevD1 Interacting protein Yeast two hybrid system Protein expression

2014-02-20

国家自然科学基金项目（31272086）

唐小丽，女，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学与基因工程；E-mail：tangxiaoli200845@163.com

杨秀芬，研究员，研究方向：蛋白激发子诱导植物抗病性作用机理；E-mail：yangxiufen@caas.cn