转PcRS基因拟南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉赵树进

（1.长江大学生命科学学院，荆州 434025；2.广州军区广州总医院，广州 510010）

转PcRS基因拟南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉1赵树进2

（1.长江大学生命科学学院，荆州 434025；2.广州军区广州总医院，广州 510010）

为确定虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）白藜芦醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）提高植物抗病性的有效性，以转PcRS 基因拟南芥为材料，对其进行了分子鉴定和抗炭疽病（Colletotrichum higginsianum）研究。利用Southern blot和 Northern blot 验证了外源PcRS基因在转基因拟南芥基因组中的整合和表达。对经过选育得到的T3代纯合株系进行离体的抗病性试验。转基因拟南芥甲醇提取物对炭疽病菌具有明显抑制作用。进一步采用点滴法接种生长 4 周的转基因拟南芥离体叶片，与野生型植株相比，转基因植株叶片坏死斑直径和坏死斑上的孢子数目都显著减少，表明转基因拟南芥通过抑制孢子的繁殖来限制炭疽病菌的定植，从而提高转基因植株对炭疽病的抗性。

虎杖 白藜芦醇合酶 转基因拟南芥 炭疽菌 抗病性

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根茎入药，是重要的白藜芦醇药源植物之一。白藜芦醇及其糖苷具有抗肿瘤、抗衰老、保护心血管系统等广泛的生物学功能［1-3］。白藜芦醇合酶（Resveratrol synthase，RS）是白藜芦醇生物合成途径中的关键酶之一，在花生（Arachis hypogaea L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、大黄（Rheum tataricum L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、川鄂爬山虎（Parthenocissus henryana （Hemsl.）Diels et Gilg）中的白藜芦醇合酶基因相继被克隆［4-7］。基因组测序显示，葡萄中的白藜芦醇合酶基因以基因家族的形式存在，白藜芦醇合酶基因高达43个，其

中20个已经被表达［8］。

现有的研究表明，白藜芦醇合酶基因在提高植物抗病性或改良作物品质方面有良好的应用前景。来源于花生的白藜芦醇合酶基因导入苜蓿（Medicago sativa L.），可提高苜蓿对茎点霉病（Phoma medicaginis）的抗性［9］；该基因转入地黄（Rehmannia glutinosa L.），则增强了地黄对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抗性［4］。将葡萄的白藜芦醇合酶基因导入小麦，增强了转基因小麦对叶锈病（Puccinia recondite）和颖枯病（Septoria nodorum）的抗性［10］；该基因导入番木瓜后，转基因的番木瓜增强了对疫霉菌（Phytophthora palmivora）的抗性［11］。但是，有些植物过量表达白藜芦醇合酶基因后，虽然体内积累了白藜芦醇或白藜芦醇苷，然而对病原菌的抗性并没有提高。例如，在转基因猕猴桃中白藜芦醇苷含量达182 μg/g鲜重，但对灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性没有提高［12］；转基因白杨的白藜芦醇苷含量高达615.2 μg/g鲜重，但对叶锈病（Melampsora pulcherrima）的抗性没有改变［13］。目前，白藜芦醇合酶基因增强植物抗病性的机理尚不清楚，白藜芦醇合酶基因家族成员的多样性使得其作用机制更为复杂。

本实验室前期已克隆了虎杖的白藜芦醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase），构建了植物表达载体pCAMBIA1380-35S-PcRS，通过转基因获得了表达PcRS 的拟南芥T1代，研究证实过量表达PcRS可促进转基因拟南芥中白藜芦醇苷的合成［14］。但PcRS基因过量表达能否提高植物抗病性尚不清楚。

本研究以转基因拟南芥T1为材料，连续多代种植。对筛选得到的T3代纯合株系，通过体外抑菌活性检测和离体抗病性试验进行抗炭疽病研究，旨在为进一步剖析PcRS基因在防御应答炭疽病侵染过程中的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以野生型拟南芥为受体，利用重组表达载体pCAMBIA1380-35S-PcRS 进行转化，所得到的转基因拟南芥 T1代，由本实验室培育。

1.1.2 菌株 供试病原真菌炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）由华南农业大学植物病理实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 转基因植株的Southern杂交 对经潮霉素抗性筛选为阳性的植株进行Southern 杂交检测。取10 μg基因组DNA，经EcoR I 酶切DNA。以引物P1（5'-CCGGTACCATGGCAGCTTCAACTGAAG-3'）和P2（5'-CCGGATCCTTAAATGATGGGCACACTTC-3'）扩增PcRS基因作为探针模板，探针标记、杂交及检测参照作者已经建立的方法［14］进行。

1.2.2 转基因植株的Northern 杂交检测 提取拟南芥叶片总RNA，用甲醛变性凝胶进行电泳，之后将凝胶中的RNA 转移至尼龙膜上，交联5 min固定RNA。以上述引物P1和P2扩增的PcRS基因作为探针模板，探针标记、杂交及检测参照作者已经建立的方法［14］进行。

1.2.3 转基因植株甲醇提取物的体外抑菌试验 生长速率法测定植物甲醇提取物的抑菌活性，参照文献［15］方法进行，所有器皿及试剂均无菌。选取生长状态一致的转基因及野生植株叶片，置于电热恒温干燥箱中以50℃烘干并粉碎。称取一定重量的植物材料干粉，加入10倍体积（V/W）的甲醇，置于避光阴凉处，每次浸提持续24 h，重复浸提3次，合并浸提液，旋转蒸发仪减压浓缩至质量浓度为1 g/mL。在无菌条件下，配制提取物干粉浓度为100 mg/mL的水溶液，用移液枪吸取1 mL到装有9 mL已融化PDA培养基（温度约60℃）的三角瓶中，充分摇匀，再倒入90 mm的培养皿中制成质量浓度为10 mg/mL 的含药培养基平板，接种炭疽菌菌饼（Φ=5.0 mm）。每处理重复3次。28℃培养7 d，再用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率（%）=［（对照菌落直径-0.5）-（处理菌落直径-0.5）］/（对照菌落直径-0.5）×100%

1.2.4 转基因拟南芥的离体抗病性鉴定 将炭疽菌接种在PDA上于28℃培养7 d，挑取黄色孢子团悬浮于无菌水中，制备105-106个孢子/ mL的孢子悬浮液。采用点滴法接种鉴定抗病性，将生长4周的拟南芥叶片剪下，用灭菌水清洗 3 次，分别置于垫

有滤纸保湿的容器中，再滴加10 μL孢子悬浮液于离体叶片上，28℃、相对湿度95%以上的培养箱培养7 d后，测定坏死斑直径。以野生型拟南芥为对照，重复3次。参照文献［16］方法测定坏死斑内孢子的数目。结果数据用SPSS19 进行统计分析。

2 结果

2.1 PcRS基因的整合与表达

经过潮霉素抗性筛选得到转基因拟南芥T1代株系L3、L4、L5、L6、L7、L8和L15。提取叶片的基因组DNA，经过EcoR I完全酶切，以PcRS基因特异片段为探针，并通过 Southern blot方法检测PcRS在植物基因组中的整合情况。杂交结果表明，所检测的7个转基因株系中，全部都有明显的杂交信号，而野生型拟南芥无任何杂交信号，表明外源T-DNA（图1-A）已经整合到转基因拟南芥的基因组中。外源PcRS基因拷贝数介于1-7之间，其中转基因拟南芥株系L4、L6和L15为单拷贝整合，株系L3、L5、L7和L8为多拷贝整合，其中株系L8 的拷贝数最高（图1-B）。

为了分析外源基因PcRS在转基因植株中的表达情况，分别提取拟南芥植株叶片的总RNA，进行Northern blot分析。结果（图1-C）显示，野生型拟南芥植株无任何杂交信号；外源基因PcRS在转基因拟南芥株系L4、L5、L6、L7和L15中均有表达，但是高拷贝整合株系L3、L8无任何杂交信号，说明外源基因PcRS在株系L3和L8中发生基因沉默。

选取单拷贝转基因株系L4和L6连续2代种植，筛选得到稳定遗传的T3代纯合子株系，以T3代纯合子株系为材料进行后续的抗病性试验。

2.2 转基因拟南芥甲醇提取物抑菌活性测定

为了验证PcRS基因的过量表达是否能提高拟南芥对炭疽病的抗性，将炭疽病菌接种在含不同株系甲醇提取物的 PDA 培养基上，培养7 d后发现，在含野生植株甲醇提取物的PDA培养基上，菌落直径较大，而在含转基因植株甲醇提取物的PDA培养基上菌落直径明显减小（图 2-A）。从抑制率来看（图2-B），在10 mg/mL的浓度下，两个转基因株系甲醇提取物对炭疽病菌均有抑制作用，平均抑菌率分别达到55.2%和50.3%，二者的抑菌率无显著差异。结果初步证明，在体外抑菌试验中过量表达PcRS基因的拟南芥可以较好地抑制炭疽病菌的生长。

图 2 转基因植株体外抑菌试验

2.3 转基因拟南芥离体叶片对炭疽病的抗性

在抗病性鉴定试验中，采用点滴法接种转基因拟南芥的离体叶片，以野生型拟南芥为对照。野生型拟南芥离体叶片接种炭疽病菌孢子悬浮液后，第3天叶片开始失绿并出现坏死点，7 d后叶片发黄并且形成大的坏死斑。而转基因拟南芥叶片失绿不明显，7 d后出现较小的坏死斑。分析接种后7 d的叶片坏死斑直径。结果（图3-A，图3-B）显示，转基因拟南芥株系L4和L6在接种7 d后，坏死斑直径的平均值显著小于野生型拟南芥，L4和L6之间的差异不显著。

进一步统计坏死斑内炭疽病菌的孢子数目，与野生型植株相比，转基因植株叶片坏死斑上的孢子数目显著减少（图3-C）。这表明转基因拟南芥通过抑制孢子的繁殖来限制炭疽病菌的定植，从而提高转基因植株对炭疽病的抗性。说明PcRS基因的超表达增强了转基因拟南芥对炭疽病菌的抗性。

图 3 转基因植株离体叶片对炭疽病的抗性测定

3 讨论

JA）等的关键信号分子的调控。例如，乙烯是植物与病原物互作中的一个重要的信号分子，是植物基础抗性所必需的，同时它也能诱导植物的抗病反应。虽然植物细胞中白藜芦醇生物合成的信号调控机制还不清楚，但相关研究表明胁迫激素，如乙稀、水杨酸、茉莉酮酸等确实能诱导RS mRNA在葡萄［20，21］或花生［22］叶片中累积。在拟南芥中防卫反应中，受SA信号调控的抗性相关基因有PR1（Pathogenesis-related protein）、PR2（b-1.3-glucanase）和 PR5（Thaumatin-like）等［23］。受ET、JA信号调控的抗性相关基因有PDF1.2（Plant defensin 1.2）、PR3（basic chitinase）和PR4（chitinase type I and II）［24］。我们推测转基因拟南芥增强了炭疽病抗性：一方面可能是由于外源PcRS 基因的组成型表达直接导致抗病性增强；另一方面可能是外源PcRS 基因与拟南芥自身防御基因发生了直接或间接的互作，激发了更强的抗病反应。所以后续试验可开展对PR1、PR2、PR5、PDF1.2、PR3和PR4等相关基因表达分析，探讨其协同抗病机制。

4 结论

本研究以转PcRS 基因拟南芥为材料，对其进行了分子鉴定和抗炭疽病研究。体外抑菌试验和离体抗病性检测结果表明，PcRS基因过量表达可提高转基因拟南芥对炭疽病的抗性。

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（责任编辑 马鑫）

Studies on the Resistance of Transgenic Arabidopsis Overexpressing PcRS to Colletotrichum higginsianum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to reveal the effectiveness of Polygonum cuspidatum resveratrol synthase（PcRS）gene in increasing tolerance to pathogenic microorganisms in foreign species, the PcRS transgenic Arabidopsis was used as material to identify its molecular characterization and study its resistance to Colletotrichum higginsianum. Integration and expression of transgene in the genome of Arabidopsis was confirmed by Southern blot and Northern blot analyses. Independent homozygous transgenic Arabidopsis lines with genetical stability were obtained after the selection of T3progenies and tested in vitro for disease resistance to C. higginsianum. Agar-plate bioassays were used to test the extracts of transgenic Arabidopsis for antifungal activity against C. higginsianum. Results showed that the mycelial growth of C. higginsianum was greatly inhibited. Then the detached leaves of 4-week-old Arabidopsis plants were used to inoculate. The lesion diameter and spore production significantly reduced on transgenic Arabidopsis. Overexpression of PcRS in transgenic Arabidopsis could restrict colonization of C. higginsianum by inhibition of spore production, resulting in enhanced resistance against C. higginsianum.

Polygonum cuspidatum Resveratrol synthase Transgenic Arabidopsis Colletotrichum higginsianum Disease resistance

2014-01-03

长江大学博士启动基金项目（801100010122），广东省自然科学基金项目（10151001002000012）

柳忠玉，女，博士，讲师，研究方向：生物制药；E-mail：zyliu2004@126.com

赵树进，教授，博士生导师，研究方向：生物制药；E-mail：gzzsjzhs@163.com