香蕉枯萎病菌全局性调控因子FocVeA基因的克隆及功能预测

漆艳香 张欣 陆英 张贺 蒲金基 喻群芳 谢艺贤

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室，海口 571101）

香蕉枯萎病菌全局性调控因子FocVeA基因的克隆及功能预测

漆艳香 张欣 陆英 张贺 蒲金基 喻群芳 谢艺贤

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室，海口 571101）

根据轮枝样镰刀菌（Fusarium verticillioides）和藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）veA同源基因相关序列设计引物，利用PCR与RT-PCR技术分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的FocVeA基因序列和开放阅读框，同时对该基因的编码蛋白进行序列特征、系统发育与结构域分析。结果表明，2个生理小种的FocVeA基因（分别命名为F1VeA和F4VeA）的DNA片段全长分别为1 693 bp 和1 690 bp，开放阅读框分别为1 599 bp 和1 596 bp，分别编码532个和531个氨基酸。F1VeA和F4VeA基因预测氨基酸序列相似性均为99%，与GenBank中公布的Fusarium spp. veA基因氨基酸序列均有78%-99%相似性。系统聚类分析显示，F1VeA和F4VeA与GenBank中已登录的轮枝样镰刀菌（F. verticillioides）和藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白质保守域搜索表明，FocVeA具有veA蛋白的功能域，属于veA蛋白家族的一员，推测该基因可能参与调控F. oxysporum f. sp. cubense的生长、毒素合成及致病性等。

香蕉枯萎病菌 FocVeA基因 克隆 序列分析

丝状真菌次级代谢是一个复杂的多层次调控过程，次级代谢物的生物合成不仅受到途径特异性转录因子及信号途径调控性因子的调控，而且受到全局性调控因子的调控［1］。研究表明，veA基因在多

种致病真菌中调控次级代谢基因簇的表达及致病性相关毒素的生物合成，并影响病原菌的形态分化和致病性，且具有广泛存在性及其功能的保守性，是一个重要的全局性调控因子［2-11］。迄今为止veA基因已经在许多丝状真菌中相继被报道，其功能和作用机制也成为一个研究热点。

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性土传病害，严重影响香蕉的产量和品质，已给中国香蕉产业造成了巨大的经济损失。研究发现，次生代谢物毒素在尖孢镰刀菌致病过程中起着重要作用，是重要的致病因子［12］。尽管镰刀菌毒素在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用已被广泛关注，迄今尚未见到有香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途径中相关调控因子的分离报道。

本研究采用同源序列法从F. oxysporum f. sp. cubense中分离veA同源基因FocVeA并进行生物信息学分析，预测FocVeA基因的蛋白结构及其功能，旨在为进一步研究该因子在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌1号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense race 1，Foc1）和香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4），由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组鉴定，保存。

1.2 方法

1.2.1 香蕉枯萎病菌基因组DNA和总RNA的制备 将供试菌株接种到PDA培养基上，28℃培养7 d，用载玻片刮取培养基表面的菌丝。分别按照BioMiga Fungal gDNA Kits和E.Z.N.A. Fungal RNA Kits说明书提取基因组DNA和总RNA。按照 M-MLV说明书操作进行cDNA第一链的合成。

1.2.2 香蕉枯萎病菌FocVeA基因的PCR扩增与克隆 根据同源物种轮枝样镰刀菌（F. verticillioides）的FvVE1基因（DQ274059）和藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1基因（FN548142）设计1对引物：AF1（5'-ATGGCTACACCATCCTCGATTCC-3'）/AR-1674（5'-CCGCCCTACTCGTCATAATACC-3'）。分别以Foc1和Foc4基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系均为25 μL：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol）2 μL，正向和反向引物各（20 μmol/L）各0.5 μL，高保真Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，模板DNA（20 ng/μL）1 μL，补灭菌双蒸水至25 μL。PCR扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物回收、连接分别按照BioMiga和TaKaRa相应的试剂盒说明书进行，阳性克隆送上海英骏公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 测序结果通过NCBI的BLAST搜索数据库进行序列同源性和保守结构域分析，用 EBI提供的在线软件ClustalW2对目的基因所编码氨基酸序列进行比对，使用Mega 4.1 软件的邻接法构建NJ 系统树。利用Softberry（http：//www. softberry.com/）、ExPASy（http：//www.expasy.org/）、WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_ psort.html/）、Euk-mPLoc 2.0、GOR4、SWISS-MODEL Repository（http：//swissmodel.expasy.org/repository/）等网上综合软件包，对目的基因分别进行编码蛋白的理化性质、细胞内定位、跨膜结构域、磷酸化位点分析和功能结构特点分析。

2 结果

2.1 基因克隆与序列分析

分别以Foc1和Foc4基因组DNA为模板，用引物AF1和AR1674进行PCR扩增，分别获得长约1 700 bp的条带（图1）。以cDNA为模板用AF1和AR1674引物进行PCR，分别获得长约1 600 bp的条带（图2）。

图1 FocVeA基因DNA PCR扩增

图2 FocVeA基因cDNA RT-PCR扩增

扩增条带的阳性克隆经PCR扩增鉴定后进行多个个体测序，序列保持一致。核苷酸序列分析表明，以基因组DNA为模板时，PCR扩增产物大小分别为1 693 bp和1 690 bp，以cDNA为模板时，PCR扩增产物大小分别为1 599 bp和1 596 bp。将DNA序列与cDNA序列进行比对，发现2个小种的FocVeA基因均含有包含1个内含子和2个外显子，内含子长度均为94 bp，这与F. verticillioides的FvVE1和F. fujikuroi的FfVel1基因结构一致。2个小种的FocVeA基因DNA序列已提交GenBank（登录号分别为：KF745043和KF745042），并分别命名为F1VeA和F4VeA。

2.2 FocVeA预测蛋白理化性质分析

利用ExPASy网站的Protparam程序对蛋白质进行组分分析，结果显示F1VeA和F4VeA基因分别编码532和531个氨基酸，只有一个氨基酸的差异，相对分子质量分别为59.28 kD 和59.17 kD；理论等电点分均为9.06。其中正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数均为66，负电荷残基（Asp+Glu）总数均为59，非极性氨基酸残基（AILMFPWV）总数分别为204和203，极性氨基酸残基（NCQGHSTY）总数均为203，不稳定系数分别为74.79和75.28，半衰期均为30 h，说明FocVeA蛋白为不稳定的微碱性蛋白。应用Hphob./Kyte & Doolittle算法，预测2个小种的FocVeA蛋白疏水性平均值分别为-0.929和-0.928，脂溶指数分别为54.1和54.2，说明FocVeA属于脂溶性、亲水性蛋白。

2.3 FocVeA预测蛋白同源性分析

经Blast同源性分析，F1VeA和F4VeA基因序列和预测的氨基酸序列相似性均为99%，与轮枝样镰刀菌（F. verticillioides）的FvVE1（ABC02879.1）、藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1（CBE54373.1）和禾谷镰刀菌（F. graminearum）的FgVe1（ADQ27445.1）等veA蛋白高度同源，相似性高达78%-99%，而与其它属的veA蛋白同源性较低，只有41%-63%的相似性。系统聚类结果（图3）表明，香蕉枯萎病菌2个生理小种的FocVeA优先与3种镰刀菌聚为一类，置信度为100%，亲缘关系最近，由此推测FocVeA蛋白属于veA蛋白家族成员。

图3 香蕉枯萎病菌FocVeA蛋白与其它丝状真菌veA蛋白序列进化树

2.4 FocVeA预测蛋白结构分析

2.4.1 保守结构域分析 利用NCBI的Blast软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）进行FocVeA推导性蛋白结构域分析，结果（图4）表明，该蛋白保守区序列集中于蛋白质的N端，且N-末端都包含一个推测的丝绒蛋白超级家族区域

（VSFD）和一个双组分核定位信号NLS区域；同时该蛋白的C-末端有一个富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的潜在PEST结构域（PM），由此推测FocVeA属于veA蛋白家族。

图4 几种镰刀菌属真菌veA蛋白保守结构域氨基酸序列的比较

2.4.2 跨膜区与信号肽分析 用Tmpred Server对FocVeA氨基酸序列进行预测，结果显示，F1VeA与F4VeA均无跨膜区。经SingaIP进行信号肽预测显示，该氨基酸序列无信号肽位点，不属于分泌蛋白。此外，WoLFPSORT和Euk-mPLoc两种不同的网络工具进行亚细胞定位预测表明，FocVeA中存在一个双组分核定位信号NLS区域，显示该基因定位于细胞核中。

2.4.3 功能结构域分析 利用GOR4在线分析显示，F1VeA 与 F4VeA分别含12.41%和12.43%的α-螺旋，12.22 %和12.24%的延伸链，75.38%和75.33%的无规则卷曲，二者均无β折叠和β转角，表明FocVeA蛋白的二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。此外，通过NetPhos 2.0的有磷酸化位点预测显示，F1VeA与F4VeA蛋白的丝氨酸（Ser）磷酸化位点分别为37个与38个，酪氨酸（Tyr）磷酸化位点分别为10个与9个，而苏氨酸（Thr）磷酸化位点均为12个，这些位点的存在说明蛋白翻译后修饰对FocVeA蛋白功能的完成或改变起到重要作用。

3 讨论

尖孢镰刀菌产生的毒素是一种具有毒性的次级代谢产物，在尖孢镰刀菌致病过程中起重要作用，是重要的致病因子。香蕉枯萎病菌在致病过程中产生的毒素（如镰刀菌酸，FA）在病菌侵入寄主后，可导致维管束细胞产生褐变、坏死等病理变化［13］。目前对香蕉枯萎病菌毒素的相关研究和报道集中在粗毒素成分［14，15］、钝化物筛选［16，17］、抗病突变体筛选［18］、与毒素泵出相关转运蛋白foABC1基因的克隆及序列分析［19］等研究，但迄今为止，有关香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途径中相关调控因子的分离仍未见报道。

全局性调控因子veA是在丝状真菌中普遍存在的调控因子之一，对丝状真菌生长发育、毒素等次级代谢产物的合成以及致病性等重要的生命过程起调控作用［20］。目前veA同源基因已相继在一些丝状

真菌中被克隆分析，但在不同的真菌中，即使是曲霉的不同种中，veA蛋白的功能也有很大差异。如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）veA、黄曲霉（A. flavus）veA、寄生曲霉（A. parasiticus）veA、轮枝样镰刀菌（F. verticillioides）FvVE1、禾谷镰刀菌（F. graminearum）FgVEA、藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）FfVel1、小麦壳针孢病菌（M. graminicola）MVE1、顶头孢霉（ Acremonium chrysogenum）AcVEA均为veA同源基因，但突变后的表型却有差异。

研究发现，veA基因参与丝状真菌菌丝生长及产孢过程。在曲霉中，A. nidulans 的veA敲除突变体（△veA）表现异常，且在有利于有性繁殖的条件下培养也不产闭囊壳，却产生大量分生孢子［2］。A. flavus的△veA也具有相似的表型，表现为分生孢子产量增加，菌核产量减少［3］。而A. parasiticus的△veA除分生孢子和菌核产量均减少外，还完全丧失了产横隔能力［4］。在镰刀菌中，△FvVE1除气生菌丝生长和菌落表面疏水性受抑制和菌丝极性改变外，还出现大型分生孢子与小分生孢子的比例增大现象［5，6］。在赤霉病菌中也有类似的现象，△FgVEA气生菌丝减少，疏水性降低，但其产孢量增加，孢子萌发延迟［7，8］。而△FfVel1气生菌丝和分生孢子数则减少，子囊壳数量则增多［9］。△MVE1与FvVEl类似，具体表现为气生菌丝减少，不受光照影响，液体培养下菌丝膨胀、极性改变［10］。与野生型相比，△AcVEA分生孢子形成提前，菌丝顶端呈高度分枝状［11］。由此说明veA在不同菌体中调控形态发育的机制可能有所差异。

研究还发现，veA基因参与调控丝状真菌毒素及色素等次级代谢产物的合成。在曲霉中，A. nidulans的△veA除完全丧失产柄曲霉毒素（ST）能力外，青霉素产量较野生型菌株也大大降低［21］。A. flavus的△veA几乎抑制了黄曲霉毒素生物合成过程所有的调控基因的表达，从而完全丧失了产黄曲霉毒素的能力［3］。在镰刀菌中也有相似现象，△FvVE1的烟曲霉毒素、串珠镰刀菌毒素的合成下降、伏马毒素合成中调控因子的表达也受抑制［5，6］；△FgVEA红色色素合成呈显著上升，但单端孢霉烯的合成显著降低［7，8］。△FfVel1的色素比卡菌素合成上升，但伏马毒素、赤霉素以及镰刀菌素C合成受抑制［9］；△AcVEA的孢菌素C的产量明显减少［11］。上述研究说明veA基因在多个丝状真菌中正调控次生代谢的合成。

另外，veA基因还影响丝状真菌的致病性。A. flavus的△veA致病力显著下降，因而不能在种子上正常定殖［22］。△FgVEA致病力丧失，以致菌体无法在麦穗上扩展侵染［7，8］。同样，接种△FfVel1后的水稻叶片也没有表现出恶苗症状［9］；而在小麦壳针孢病菌中，△MVE1的致病性却没有改变［10］。这些研究结果说明veA在不同丝状真菌致病过程中的作用也各不相同。

Foc1和Foc4在侵染不同种的香蕉时存在较大的差异，Foc1只侵染粉蕉而Foc4几乎能侵染所有香蕉品种。本研究获得了香蕉枯萎病菌2个生理小种的FocVeA基因，且F1VeA和F4VeA的推测编码蛋白仅1个氨基酸的差异，即F1VeA的潜在PEST结构域比F4VeA多了一个脯氨酸（P）。PEST结构域与蛋白快速折叠有关［9］，由此说明FocVeA基因有可能是造成寄主差异和致病力差异的主要原因之一。其次，F1VeA和F4VeA的推测蛋白序列与veA同源基因FvVE1、FfVel1及FgVEA编码蛋白高度相似，但该基因是否与香蕉枯萎病菌的生长发育、毒素合成及致病性相关，还有待进一步研究证实。

4 结论

本研究通过同源序列法获得了香蕉枯萎病菌全局性调控因子FocVeA基因序列和开放阅读框，结果表明，2个生理小种F1VeA和F4VeA的DNA片段全长分别为1 693 bp 和1 690 bp，分别编码532个和531个氨基酸，预测氨基酸序列相似性均为99%，系统聚类分析显示，F1VeA和F4VeA与GenBank中已登录的轮枝样镰刀菌（F. verticillioides）和藤仓镰刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白质保守域搜索表明，FocVeA具有veA蛋白的功能域，属于veA蛋白家族的一员，推测该基因可能参与调控F. oxysporum f. sp. cubense的生长、毒素合成及致病性等。

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（责任编辑 马鑫）

Cloning and Functional Prediction of the Global Regulator FocVeA Gene from Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Qi Yanxiang Zhang Xin Lu Ying Zhang He Pu Jinji Yu Qunfang Xie Yixian
（Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests，Ministry of Agriculture，Environment and Plant Protection Institute，CATAS，Haikou 571101）

Based on the conserved amino acid sequence of veA homologs from F. verticillioides and F. fujikuroi, FocVeA gene and its open reading frame of F. oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4（Foc1 and Foc4）were cloned by PCR and RT-PCR. Sequences characterization, phylogenetic clustering and conserved domains on the two predicted proteins of FocVeA gene were also analyzed, respectively. The results showed that the complete DNA sequences of FocVeA from Foc1 and Foc4（named as F1VeA and F4VeA）were 1 693 bp and 1 690 bp, respectively. The cDNA of F1VeA and F4VeA were 1 599 bp and 1 596 bp, and encoded a deduced protein of 532 amino acid and 531 amino acid, respectively. The deduced amino acid sequences of F1VeA and F4VeA shared 99% similar to each other, and had 78%-99% similarity with the sequences of veA factor from isolates of Fusarium spp., respectively. Phylogenetic clustering suggested that the amino acid sequences of F1VeA and F4VeA showed high similarity to veA homologs of F. verticillioides and F. fujikuroi deposited in GenBank. Conservative structure domain analysis showed that F1VeA and F4VeA had the sequence characteristics of veA gene family in filamentous fungi, which meant that FocVeA might involve in morphological development, toxin biosynthesis and pathogenicity of F. oxysporum f. sp. cubense.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense FoVeA gene Cloning Sequence analysis

2014-03-20

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-32-04），中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2013hzs1J009）

漆艳香，女，博士，副研究员，研究方向：热带果树病害的诊断、病原学及防治；E-mail：qiyanxiang@126.com

谢艺贤，男，研究员，研究方向：热带果树病害及防治；E-mail：yixian81@126.com