木薯干旱响应基因MeHDS1的克隆与分析

于晓玲阮孟斌王树昌彭明

（1.海南大学农学院，海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）

木薯干旱响应基因MeHDS1的克隆与分析

于晓玲1，2阮孟斌2王树昌2彭明2

（1.海南大学农学院，海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）

HD-Zip是植物中所特有的转录因子，在植物体响应环境因子过程中起着重要的作用。以木薯cDNA为模板，利用RT-PCR技术从木薯中克隆了一个HD-Zip家族成员基因全长，命名为MeHDS1。序列分析结果表明，MeHDS1具有822个氨基酸，分子量89.07 kD，等电点为5.79，其开放阅读框长2 469 bp，具有典型HD结构域及START结构域。该转录因子与棉花GL2蛋白的同源性很高，推断其同属第IV亚家族。MeHDS1蛋白内含有一个核定位信号，亚细胞定位试验结果也证明，MeHDS1蛋白定位于细胞核与细胞壁中。实时荧光PCR分析表明，该基因在木薯根部表达量最高，受干旱诱导上调表达。通过对其生物信息学分析及其在木薯中表达谱分析结果表明，MeHDS1可能作为转录调控因子参与木薯非生物胁迫应答反应。

HD-Zip转录因子 木薯 表达分析 亚细胞定位

木薯（Manihot esculenta Crantz），是大戟科植物，原产于南美洲亚马逊河盆地，一年生木本灌木，是世界上第5大粮食作物，是非洲一些国家人们生存的主要食物来源［1］。木薯最大的优点是不与其他粮食作物争地，在其他作物无法生长的干旱地区，可以很好的生长。这一特性值得人们进行研究。抗旱相关基因的表达需经历逆境信号的接受、转导、诱导基因的转录以及功能基因的转录后3个不同水平的调节。在逆境条件下，逆境相关的转录因子能与顺式作用元件结合，从而调节功能基因的表达和信号转导，它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因的同时表达。

HD-ZIP家族这一植物界独有的转录因子，包含有单一的homeodomain（HD）［2］与一个亮氨酸拉链形成二聚体结构（b-zip）［3］。拟南芥中有48个成员［3，4］，蛋白参与植物器官组织的发育过程、激素

作用途径、以及对环境条件的反应过程［5］。根据结构域的保守性、基因结构及独特的生理功能，HDZIP可分为4个亚家族。其中，HD-Zip IV的结构与HD-Zip III相似，只是缺少一个MEKHLA结构域。这类蛋白与GL2家族相似性很高，也被命名为HDZip GL2［6］。HD-Zip IV的特征是具有TAAA core，其功能可能调控植物表皮细胞的分化［7］。科学家已经从拟南芥［5，8，9］、棉花［10］、水稻［11］、玉米［12］等不同植物中克隆得到GL2类转录因子，并对其功能进行了研究，但在木薯中尚未有相关研究报道。本研究从木薯中分离得到1个GL2类转录因子基因MeHDS1，探讨该基因在不同组织中的表达差异及其对逆境胁迫的反应，并对该蛋白进行亚细胞定位鉴定，旨在为MeHDS1基因的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯华南124（SC124）由中国热带农业科学院木薯种质资源圃提供；烟草（Nicotiana tabacum L.）由本实验室保存；载体pCAMBIA1300：GFP由本试验室保存；引物合成及基因克隆测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MeHDS1基因克隆 采用改良的Tris方法［13］提取木薯叶片与根部混合样品总RNA，依照M-MLV reverse transcriptase试剂盒（TIANGEN）操作说明合成第一链cDNA。根据HD-Zip基因家族结构特点，对木薯序列数据库（http：//www.phytozome.net/cass ava.php）中序列进行BLAST比对，获得一个与植物中HD-Zip转录因子具有较高同源性的cDNA序列。利用软件Vector NTI Advance 10设计引物：5'-TGTCGACGTGGTGAAACTT AATTTTAAG-3'（含有Sal I位点）；5'-TGGATCCCACAAAAGACCAGTTTAT-3'（含有BamH I位点），以第一链cDNA为摸板，通过高保真酶进行PCR扩增，PCR反应条件为：98℃10 s，55℃ 10 s，72℃ 2 min，35个 循 环；72℃5 min。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得的具有完整开放阅读框的基因序列进行下面进一步的分析。

1.2.2 生物信息学分析 利用在线软件进行生物信息学分析：（1）基因结构域分析（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；（2）预测MeHDS1分子量及等电点：Compute pl/Mwtool，ExPASy软件（http：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）；（3） 转录因子核定位信号预测：PSORT（http：//psort.hgc. jp/）；（4）蛋白质空间结构预测（http：//www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/）。

1.2.3 表达模式分析 待木薯SC124生长3个月（株高约1 m）后，选取长势相近的植株进行断水干旱处理，以正常浇水的植株作为对照处理。每个处理3盆植株，平行3次重复。12 d后，分别提取木薯SC124的根、不同位置叶片、混合叶片总RNA，经DNaseI消化后，反转录第一链cDNA。采用qPCR的方法对MeHDS1基因的表达谱进行分析。

1.2.4 植物表达载体构建 中间载体pMD18-MeHDS1和植物表达载体pCAMBIA1300：GFP质粒各约2 μg，经限制性内切酶BamH I和Sal I 37℃消化3 h后，凝胶回收目的条带；经T4 DNA连接酶16℃连接过夜后，转化DH5α感受态细胞。对重组质粒进行酶切、PCR鉴定，最终阳性克隆命名为pCAMBIA1300∷GFP∷MeHDS1。

将构建好的植物表达载体通过冻融法（液氮中5 min，42℃水浴5 min）转化农杆菌LBA4404感受态细胞，在含有Rif+25 mg/L、Kan+50 mg/L和Chl+25 mg/L的YEB平板上培养，PCR鉴定为阳性的克隆，可进行后续的亚细胞定位试验。

1.2.5 亚细胞定位 采用6 000 r/min离心10 min，收集LBA4404/P1300∷GFP∷MeHDS1（OD600为0.8）菌体，利用10 mmol/L MgCl2（+100 μmol/L AS）缓冲液重悬菌体，采用针筒注射的方法，注射烟草叶片背面细胞，共培养72 h后，采用共聚焦显微镜观察，拍照分析。

2 结果

2.1 MeHDS1基因克隆与序列分析

国家以改善孤残儿童成长环境、提高孤残儿童生活质量为目标，提出“十一五”[1]和“十二五”儿童福利机构建设蓝天计划暨儿童福利机构设备配置实施方案[2]（以下简称“蓝天计划”）。切实加强儿童福利机构基础设施建设，保障孤残儿童的集中养护、救治、教育和康复。

通过RT-PCR方法获得一个来源于木薯SC124品种的，具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF），长2 469 bp的基因序列。该基因序列经过结构域分析（图1）发现其包含一个HD 结构域（长

59个氨基酸）、一个START结构域（长229个氨基酸）及一个LZ区域。NCBI数据库BLAST-p结果表明，该序列与葡萄HD-Zip基因（GenBank序列号为XP_002272264）具有很高的同源性（93%）。

图1 MeHDS1氨基酸序列（A）及蛋白保守结构域（B）分析

序列分析表明：MeHDS1基因编码822个氨基酸，预测其分子量为89.07 kD，等电点为5.79。在基因内发现一个核定位信号（P113-PRKKRYH），符合转录因子细胞区室定位特征；通过对MeHDS1蛋白的空间结构预测分析发现其具有3个螺旋结构（图2）。

图2 MeHDS1蛋白空间结构预测

BLAST-p分析结果表明，MeHDS1蛋白与棉花GL2蛋白的同源性很高，因此推测其可能属于HD-Zip IV亚家族成员。将MeHDS1氨基酸序列与GenBank中已登录的、已知功能的拟南芥HD-Zip IV亚家族成员进行序列比对，并构建系统进化树，进行系统发育分析。结果（图3）显示，MeHDS1与GL2基因同源性最高，因此进一步推断MeHDS1可能是HD-Zip IV亚家族GL2类转录因子。

图3 MeHDS1与其他物种已知为HD-Zip IV家族系统进化树分析

2.2 表达模式分析

选取生长3个月，长势均匀的木薯SC124，进行干旱处理，干旱12 d后，提取叶片、叶柄和根的总RNA，反转录合成第一链cDNA。针对基因区特异性片段设计引物，采用Real-time PCR手段分析MeHDS1基因在木薯不同组织中的表达模式，结果（图4-A）显示：干旱处理12 d的木薯不同组织中，MeHDS1基因的表达量存在差异，在叶中的表达量明显高于根中；干旱处理后，MeHDS1基因在根与叶片组织中的表达量都有不同程度的增加，但增加的幅度在根中较叶片中要大。

图4 q-PCR分析MeHDS1基因表达模式

2.3 植物表达载体构建

利用带有酶切位点的引物进行PCR扩增，得到2 469 bp的MeHDS1基因的cDNA编码序列，条带单一，回收后送往测序，验证序列为正确序列。将目的片段纯化后，用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切（图5-A），回收目标片段（图5-A-MeHDS1箭头所示）；同时，将pCAMBIA1300∷GFP用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切（图5-A），回收回收目标大片段（图5-A-1300箭头所示）；将MeHDS1目标片段与pCAMBIA1300∷GFP大片段利用T4 DNA连接酶进行连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于带有Kan+抗性的LB平板上筛选阳性克隆。将PCR/酶切鉴定为阳性的克隆质粒（图5-B）进行测序，结果表明序列是正确的，无移码突变，命名为pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP。采用冻融法将pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP质粒转入农杆菌LBA4404菌株，用于后续功能分析。

图5 限制性双酶切图

2.4 亚细胞定位

本试验将构建好的带有1300∷GFP∷MeHDS1表达框的植物表达载体，转化农杆菌LBA4404。采用注射方法转化烟草叶片，共培养72 h。将共培养后的叶片经20%甘油处理后，进行压片，置于激光共聚焦显微镜下观察。荧光分析结果（图6）表明：融合了GFP的MeHDS1蛋白在烟草叶片细胞的细胞

壁及核内表达，初步表明MeHDS1蛋白定位于细胞核内和细胞壁上。

图6 MeHDS1蛋白的亚细胞定位

3 讨论

木薯属于典型的抗旱、耐贫瘠作物［14］。我国南方地区，在其他作物无法生长的边缘地带都可以见到它们的身影，其作用机理尚无确切的报道。针对木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用机理的研究，无论是对其他作物的遗传改良还是自身品种改良都具有尤为重要的作用。

本研究自SC124木薯品种中克隆得到一个干旱胁迫下差异表达基因的MeHDS1。生物信息学分析结果显示，该蛋白具有一个核定位信号；基因的亚细胞定位试验结果表明MeHDS1在核及细胞壁中得到表达，因此推测，MeHDS1可能是一种转录因子。转录因子是细胞中重要的调节机制［15］，目前得到的HD-Zip家族成员多是定位于细胞核中［16］。

MeHDS1蛋白空间结构预测表明，该蛋白具有1个保守的HD结构域、1个LZ区域、1个START结构域（Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer）。因此，初步推断该基因应该属于HDZip家族中的一员；空间结构分析显示MeHDS1蛋白具有典型的3个螺旋结构，HD-zip家族多是该结构［5］。另外，通过BLAST分析得知，MeHDS1蛋白与棉花GL2、小麦TaGL9及拟南芥AtGL2都具有很高的同源性。因此，我们推断MeHDS1蛋白可能属于HD-Zip IV亚家族。

HD-Zip IV这类蛋白与GL2家族相似性很高，也被命名为HD-Zip GL2［6］，它的特征是具有TAAA core，其功能可能调控植物表皮细胞的分化［7］。干旱胁迫下，木薯根系中MeHDS1蛋白表达显著升高，我们推测干旱胁迫下该蛋白可能参与根细胞分化的调节，具体作用机制有待进一步研究。

4 结论

本研究基于木薯SC124 cDNA，利用RTPCR技术成功克隆获得1个HD-Zip家族成员基因MeHDS1。序列分析表明，其编码822个氨基酸，分子量89.07 kD，等电点为5.79，其开放阅读框长2 469 bp，具有典型HD结构域及START结构域。系统进化树分析结果表明，其与棉花GL2蛋白的同源性很高，推断其同属第IV亚家族。生物信息学分析表明MeHDS1蛋白内含有一个核定位信号，通过亚细胞定位试验证明了此推断，该蛋白在细胞核中优势表达。实时荧光定量PCR分析结果表明：MeHDS1基因在叶片中的表达量比根部高；干旱胁迫可不同程度提高该基因的表达，且MeHDS1基因在根部表达量升高的幅度较叶片组织增幅要大；干旱胁迫条件下，木薯植株顶端功能叶中MeHDS1基因的表达量显著高于底部叶片。将MeHDS1基因构建了植物过量表达载体，并成功在烟草叶片中实现表达。

［1］Anderson JV, Delseny M, Fregene MA, et al. An EST resource for cassava and other species of Euphorbiaceae［J］. Plant Mol Biol, 2004, 56：527-539.

［2］Moens CB, Selleri L. Hox cofactors in vertebrate development［J］. Dev Biol, 2006, 291：193-206.

［3］Schena M, Davis RW. HD-Zip proteins：members of an Arabidopsis homeodomain protein superfamily［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89：3894-3898.

［4］Elhiti M, Stasolla C. Structure and function of homodomain-leucine zipper（HD-Zip）proteins［J］. Plant Signal Behav, 2009, 4：86-88.

［5］Ariel FD, Manavella PA, Dezar CA, et al. The true story of the HDZip family［J］. Trends Plant Sci, 2007, 12：419-426.

［6］Nakamura M, Katsumata H, Abe M, et al. Characterization of the class IV homeodomain-Leucine Zipper gene family in Arabidopsis［J］. Plant Physiol, 2006, 141：1363-1375.

［7］Guan XY, Li QJ, Shan CM, et al. The HD-Zip IV gene GaHOX1 from cotton is a functional homologue of the Arabidopsis GLABRA2［J］. Physiol Plant, 2008, 134：174-182.

［8］Szymanski DB, Jilk RA, Pollock SM, et al. Control of GL2 expression in Arabidopsis leaves and trichomes［J］. Development, 1998, 125：1161-1171.

［9］Fyvie MJ, Murray JA, Kilby NJ. Mosaic analysis of GL2 gene expression and cell layer autonomy during the specification of Arabidopsis leaf trichomes［J］. Genesis, 2000, 28：68-74.

［10］Ohashi Y, Oka A, Ruberti I, et al. Entopically additive expression of GLABRA2 alters the frequency and spacing of trichome

initiation［J］. Plant J, 2002, 29：359-369.

［11］Yang JY, Chung MC, Tu CY, et al. OSTF1：a HD-GL2 family homeobox gene is developmentally regulated during early embryogenesis in rice［J］. Plant Cell Physiol, 2002, 43：628-638.

［12］Vernoud V, Laigle G, Rozier F, et al. The HD-ZIP IV transcription factor OCL4 is necessary for trichome patterning and anther development in maize［J］. Plant J, 2009, 59：883-894.

［13］阮孟斌, 李文彬, 于晓玲, 等. 一种适用于多糖多酚植物的高质量RNA快速提取方法［J］. 热带作物学报, 2011, 32：1-7.

［14］El-Sharkawy MA . Cassava biology and physiology［J］. Plant Mol Biol, 2004, 56：481-501.

［15］Igarashi D, Ishida S, Fukazawa J, et al. 14-3-3 proteins regulate intracellular localization of the bZIP transcriptional activator RSG［J］. Plant Cell, 2001, 13：2483-2497.

［16］Zou LP, Sun XH, Zhang ZG, et al. Leaf rolling controlled by the homeodomain leucine zipper class IV gene Roc5 in rice［J］. Plant Physiol, 2011, 156：1589-1602.

（责任编辑 狄艳红）

Cloning and Functional Analysis of MeHDS1 from Cassava Responsing Drought

Yu Xiaoling1，2Ruan Mengbin2Wang Shuchang1，2Peng Ming2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101）

The HD-Zip transcription factors are unique to the plant kingdom. They play important roles in plant responsing to the environmental factors. Based on the cDNA of cassava, using RT-PCR technology, one gene sequence was obtained, named it as MeHDS1. The sequence was analyzed, we got a 2 469 bp gene which have integrated ORF, MeHDS1 encoded a protein which contained 822 amino acids（89.07 kD）with an isoelectric point of 5.79. MeHDS1 have typical HD-domain, START domain. It has high homology to GL2 gene of cotton and Arabidopsis, so it might belong to HD-Zip IV subfamily. There have a nuclear localization signal in MeHDS1 protein, and which was localized in the nucleus and cell wall by subcellular localization assay in tobacco epidermal cells. Real-time PCR results showed that, MeHDS1 was upregulated under drought, and its variation of expression was more highly in root cells than that in leaves cells. Through its bioinformatics and expression analysis, we concluded that MeHDS1 may be involved in cassava abiotic stress responsed as a transcription factor.

HD-Zip transcription factor Cassava Expression analysis Subcellular localization

2014-02-28

国家重点基础研究发展计划（2010CB126601），海南省重大科技专项（ZDZX2013023-1-10）

于晓玲，女，博士研究生，副研究员，研究方向：农业生物技术；E-mail：lingdang01@126.com

彭明，男，博士，研究员，研究方向：植物遗传学；E-mail：mmpeng_2000@yahoo.com