野生苦菜体外抗氧化及抑制肿瘤活性研究

陈琼，阚聪，2，寇晓虹，*，王庚

（1.天津大学化工学院食品科学系，天津300072；2.海南大学食品学院食品科学与工程系，海南海口570228）

野生苦菜体外抗氧化及抑制肿瘤活性研究

陈琼1，阚聪1，2，寇晓虹1，*，王庚1

（1.天津大学化工学院食品科学系，天津300072；2.海南大学食品学院食品科学与工程系，海南海口570228）

以野生苦菜为原料，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除能力、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）清除能力、羟基自由基清除能力和铁离子还原能力法评定其抗氧化能力，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法评定苦菜提取物对雌激素依赖性人类乳腺癌细胞MCF-7和雌激素非依赖性人乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制活性。结果表明，苦菜甲醇提取物对ABTS、DPPH都具有较强的清除能力，且具有较强的铁离子还原能力，对雌激素依赖性人类乳腺癌细胞MCF-7和雌激素非依赖性人乳腺癌细胞MDA-MB-231均有显著的抑制活性。苦菜的甲醇提取物对MCF-7和MDA-MB-231半抑制率分别为99、107μg/mL。

苦菜；抗氧化；抑制肿瘤

苦菜，学名Ixeris Sonchifolia，为菊科苦苣属的一年生或两年生草本植物，又称为苦荬菜、苣荬菜[1]。分布于中国东北、华北，华东和华南等省区。苦菜，味微苦，是著名的中药，对糖尿病、心脑血管病、动脉硬化等多种中老年疾病以及由细菌引起的各种炎症、失眠、神经衰弱等疾病都有很好的预防和治疗作用[2]。然而，目前总体关于苦菜的研究较少且大多在国内。国内外关于苦菜的研究有苦菜所含成分的分析[3-5]、倍半萜烯的分离鉴定[6]、苦菜黄酮测定及抗氧化作用[7]，苦菜黄酮对缺血再灌注损伤保护作用[8-9]，人体嗜中性粒细胞的调节作用[10]，及苦菜提取物在抗凝血[11]、抑菌[12]、抗炎[13]等方面的作用，然而还缺乏苦菜尤其是野生苦菜抑制人乳腺癌细胞活性的报道，对其抑制乳腺肿瘤作用缺乏全面的了解。本文用甲醇提取野生苦菜中活性成分，并用甲醇提取物对苦菜抗氧化及人类乳腺癌细胞活性进行评价，为野生苦菜资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料

野生苦菜：采自山西省怀仁县。

1.1.2 化学试剂

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、Trolox、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、Vitamine C（VC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、小牛血清（FBS）、1640培养基、脱氧核糖（2-Deoxy-D-ribose：DR）、硫代巴比妥酸（TBA）、齐墩果酸均为分析纯，购买于美国sigma公司（St.Louis，Mo.，U.S.A.）；甲醇、六氰合铁酸钾、三氯乙酸、过硫酸钾、二甲基亚砜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、过氧化氢、邻苯三酚、氯化铁、蒸馏水均为分析纯购于天津市江天化工技术有限公司（天津，中国）。

1.1.3 肿瘤细胞

雌激素依赖性人类乳腺癌细胞MCF-7，雌激素非依赖性人乳腺癌细胞MDA-MB-231（南开大学生命科学院惠赠）。

1.1.4 主要仪器

FD-1C-50型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；HERACELL 150iCO2培养箱、MULTISKAN FC酶标仪：Thermo Scientific；HH型数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂。

2 方法

2.1 苦菜的甲醇提取物制备

取新鲜苦菜4 kg，冷冻干燥，破粹成粉，过80目筛，按料液比1∶10（g∶mL）加入甲醇，于室温下搅拌提取8 h，通过旋转蒸发浓缩提取液，即得甲醇相提取物（MF），重复上述过程共得提取物，冷冻干燥后置于-20℃冰箱保存备用。

2.2 苦菜提取物抗氧化活性的研究

DPPH自由基清除能力的测定方法参考Yu L．等和Hu Jikai等方法[14-15]；羟基自由基清除能力的测定参考郭丽萍等方法[16]；ABTS自由基清除能力的测定参考Roberta re Nicoletta Pellegrini等方法[17]；总还原能力的测定参考冯翠萍等方法[18]。

2.3 苦菜提取物抗癌活性的研究

采用MTT法评价提取物抑制肿瘤增殖能力[19-20]。

取对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7均以0.25%胰蛋白酶消化，然后用RPMI-1640培养基（含10%FBS）稀释至浓度为2.5×105/mL的细胞悬液。于96孔细胞培养板中以每孔100μL的量加样，然后置于37℃、5%CO2培养箱中连续培养8 h~10 h。实验组每孔添加新的含不同浓度样品的完全培养基100μL，对照组每孔添加等体积的完全培养基，每组设有3个复孔，置于37℃、5%CO2条件下连续培养96 h。培养结束，弃上清液，每孔加入5mg/mL的含无血清培养基的MTT溶液20μL，继续在培养箱中培养4 h。取出后每孔分别加入DMSO 150μL，轻轻震荡10min使沉淀溶解，在酶标仪上波长570 nm处检测光密度OD值，计算抑制率。

抑制率（%）=（1-OD1/OD2）×100%

式中：OD1代表测得的样品组吸光度值；OD2代表对照组的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 苦菜甲醇提取物对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除法是一种广泛用于测定样品的清除自由基能力的方法。DPPH自由基是可以稳定存在于有机溶剂中的、以氮为中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，特征吸收峰出现在波长517 nm处，当其遇到自由基清除剂时，孤对电子配对，其最大吸收波长处的吸收会消失或减弱。由此可见，通过测定吸收减弱的程度，可以评价该自由基清除剂清除能力的强弱[21]。

图1 不同浓度苦菜甲醇提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radicalscavenging capacity under different concentration of Ixeris Sonchifolia extracts

如图1所示，浓度在0.05mg/mL~0.2mg/mL苦菜甲醇提取物对DPPH自由基有明显的清除效果，并且呈现显著剂量效应关系。当浓度达到0.2mg/mL时清除能力最强（达到0.9），浓度大于0.2mg/mL后对DPPH自由基的清除趋势趋于平缓。

3.2 苦菜甲醇提取物对羟基自由基的清除能力

如图2所示，随苦菜甲醇提取物浓度增大，其对羟基自由基的清除率无明显增加，羟基自由基率与浓度没有明显剂量依赖性关系，说明苦菜提取物对羟基自由基没有显著的清除效果。

图2 不同浓度苦菜甲醇提取物对羟基自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl free radicalscavenging capacity under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

3.3 苦菜甲醇提取物对ABTS自由基的清除能力

图3 不同浓度苦菜甲醇提取物对ABTS自由基的清除能力Fig.3 ABTS radicalscavenging capacity under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

ABTS常被食品工业和农业的科研工作者用于评价食品的抗氧化性[22]。加入过硫酸钠，ABTS可以转化成蓝色的自由基阳离子形式，在734 nm处有吸收峰[23]。ABTS和抗氧化物质如多酚、硫醇或VC有很强的反应活性，并反映转化成无色的中性离子形式[24]，因此可以用比色法进行抗氧化评定。

如图3所示，苦菜甲醇提取物在0.01 mg/mL～0.4 mg/mL范围内随着浓度不断增加，提取物对于ABTS清除能力也不断增加，呈现明显剂量依赖性关系。由此可知，苦菜提取物对ABTS自由基有着较强的清除能力。

3.4 苦菜甲醇提取物对总还原能力的影响

对铁离子还原过程将K3Fe（CN）6还原成黄血盐K4[Fe（CN）6]，再利用Fe2+形成普鲁士蓝Fe4（Fe（CN）6。以普鲁士蓝生成量作为指标。700 nm吸光值反映普鲁士蓝的生成量，吸光度值越大，样品还原力值愈强，表示抗氧化效果愈佳[25]。

如图4所示，苦菜甲醇提取物在0.01 mg/mL～0.4 mg/mL范围内，随着浓度不断增加，提取物对于铁离子还原能力也不断增强，呈现明显剂量依赖性关系。

图4 不同浓度苦菜甲醇提取物的总还原能力Fig.4 Total reducing power under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

3.5 苦菜甲醇提取物对MDA-MB-231的抑制效果

图5 不同浓度苦菜甲醇提取物对MDA细胞存活率影响Fig.5 Effectof different concentration of Ixeris Sonchifolia extractson Inhibition ratio of huMan breast cancer MDA-MB-231

如图5所示，与空白对照组相比，随苦菜甲醇提取物浓度（0～180μg/mL）不断增大，雌激素非依赖性人乳腺癌细胞MDA-MB-231的存活率不断下降，呈现显著地剂量效应关系。当甲醇提取物浓度达180μg/mL，MDA-MB-231细胞的存活率为30.4%。由此可见，苦菜甲醇提取物对MDA-MB-231细胞有明显的抑制活性。显著抑制肿瘤细胞增殖，提取物对MDA-MB-231细胞的半抑制率IC50为99μg/mL。

3.6 苦菜甲醇提取物对MCF-7抑制效果

图6 不同浓度苦菜甲醇提取物对MCF-7细胞存活率的影响Fig.6 Effectof different concentration of IxerisSonchifolia extractson Inhibition ratio of human breast cancer MCF-7

由图6可知，随苦菜甲醇提取物浓度（0～180μg/mL）不断增大，雌激素依赖性人乳腺癌细胞MCF-7的存活率不断减小，成剂量效应关系。当甲醇提取物浓度达180μg/mL，MCF-7细胞的存活率为34.2%。由此可见，苦菜甲醇提取物对MCF-7细胞有明显的抑制活性。提取物对MCF-7细胞的IC50为107μg/mL。如图5、6可知，苦菜的甲醇提取物对MDA-MB-231和MCF-7这两种癌细胞的活性有较好的抑制作用。当苦菜的浓度增加至180μg/mL时，两种癌细胞的存活率均降至30%左右。

4 结论

本文研究结果表明，苦菜甲醇提取物对ABTS和DPPH自由基具有较强的清除能力，且具有较强的铁离子还原能力，说明实验用苦菜有良好的抗氧化活性。苦菜甲醇提取物雌激素依赖性人类乳腺癌细胞MCF-7和雌激素非依赖性人乳腺癌细胞MDA-MB-231均有显著的抑制活性。因此，野生苦菜作为天然抑癌化合物的筛选材料具有潜在价值。

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The Antioxidant and Tumor Inhibiting Activity ofW ild Ixeris Sonchifolia

CHENQiong1，KANCong1，2，KOU Xiao-hong1，*，WANGGeng1
（1.Food Science，SchoolofChemicalengineeringand Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.Departmentof Food Science and Engineering，Schoolof Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Thewild Ixeris Sonchifolia（froMShanxi，China）was used to evaluate itsantioxidantactivity and tumor inhibiting activity.The antioxidant activity was evaluated using the 2，2-diphenyl-1-picrylhydracyl（DPPH·），hydroxyl free radical（OH·）and 2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）（ABTS·+）scavengingmethods and the ferric reducing antioxidant power assay.3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliuMbromide（MTT）assay was employed to evaluate its tumor inhibiting activity.The results showed that the Ixeris Sonchifolia extracts had excellent DPPH·，ABTS·+scavenging capacity and reducing power.The Ixeris Sonchifolia extracts can significantly inhibit human breast tumor MDA-MB231（estrogenindependent tumor）and MCF-7（estrogen-dependent tumor）.The IC50（halfmaximal inhibitory concentration）ofMDA-MB231 andMCF-7were99and 107μg/mL，respectively.

Ixeris Sonchifolia；antioxidantactivity；anticancer

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.005

2014-09-15

陈琼（1990—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：功能性食品。

*通信作者：寇晓虹，硕导，博士。