电制备巨囊泡的方法和机理探索

盛 洁，哈丽旦，王 平，蒋中英

（1.伊犁师范学院电子与信息工程学院，伊宁835000；2.伊犁师范学院化学与生物科学学院，伊宁835000）

1 引 言

细胞是生命现象的物质结构基础，其参与物质、能量和信息交换等生命活动.由于真实的细胞膜中各种磷脂和蛋白质等分子的形态和刚性等复杂因素影响，使实验上直接研究活细胞存在诸多条件限制和困难.因此，需构筑简化的模拟生物膜体系以供仿生、载药和生物传感器等方面的研究.

囊泡作为两亲性分子形成的封闭双层结构，其物理性质及对外界刺激和响应接近真实细胞.其中巨囊泡 （giant unilamellar vesicles，简记为GUVs）具有粒径大 （10～200μm）、利于普通显微镜观测和实施微操作等优点.被用于细胞膜间相互作用［1］、细胞形变模拟［2］、细胞膜与其它物质 的 相 互 作 用［3，4］、药 物 输 运［5，6］和 微 观 可 控 反应［7］等研究.已有的温柔水化法和超声法制备的囊泡，存在粒径小、形状不规则以及操作不可控等问题.自1986年，Angelova和Dimitrov提出了一种电制备GUVs的方法，并用透明的氧化铟锡（indium tin oxide，简记为ITO）导电玻璃代替铂丝电极制备出GUVs［8］.近几年，电制备作为获得GUVs的常用方法，对其有效性的提高和机理的研究逐渐增多.其中，Estes等人采用旋涂法提高了干磷脂膜的均匀度，利用流动舱技术实现了低盐环境中电制备GUVs［9］.但基于各种因素 （电场、磷脂、缓冲液和温度等）的影响，对电制备GUVs还有待更深入和系统的研究.

因此，这里利用显微镜原位观察种类、组份以及浓度不同的干磷脂膜在超纯水或蔗糖溶液中电制备GUVs的过程.分析了电场、磷脂、缓冲液和温度等诸多因素对形成GUVs的影响.该研究完善了电制备GUVs法，诠释了双亲性磷脂分子自组装的动力学机理.为生理条件下电制备粒径大的GUVs悬浮液提供了实验平台.

2 实验部分

2.1 材 料

图1 DOPC，DPPC，DMPC，DOTAP，DOPS，Ch 和RhB-PE的分子结构式Fig.1 Structure formulas of DOPC，DPPC，DMPC，DOTAP，DOPS，Ch and RhB-PE molecules

磷脂二油酰磷脂酰胆碱 （DOPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱 （DPPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二油酰基三甲氨基丙烷 （DOTAP）、二油基磷脂酰丝氨酸 （DOPS）、胆固醇 （Ch）和染色剂 （罗丹明B 磷脂酰乙醇胺，简记为RhBPE）购 于 美 国Sigma 公 司.DOPC，DPPC，DMPC为电双性磷脂，DOTAP 和DOPS 分别为正电性与负电性磷脂，分子式如图1所示.氯仿、甲醇和蔗糖均为国产分析纯.实验用水是经Milli-Q 离子交换净化系统处理所得的超纯水 （ρ ＞18 MΩ×cm）.ITO 导电玻璃购于深圳莱宝高科技股份有限公司，玻璃厚度1.1 mm，方块电阻

15Ω／sq.

2.2 仪器和电制备装置

数字合成函数信号发生器 （SFG-1013，GW INSTEK，台湾）提供电制备的低频正弦信号，数字示波器 （GDS-2062，GW INSTEK，台湾）用于监测.显微镜热台 （HCS60，INSTEC，美国）用于电制备过程中的温度控制.采用倒置显微镜（IX71S8F-3，OLYMPUS，日本）的相差和荧光功能实时观察电形成过程 （物镜：10×）.

以两片ITO 玻璃夹聚四氟乙烯 （PTFE）板，用真空硅脂粘合构成电制备GUVs 的简易装置［10］，PTFE板上挖15mm×10mm×1mm 的区域，如图2所示.交流 （AC）电场或直流 （DC）电场通过铜线施加于ITO 电极上.

图2 ITO 电极构成的电制备GUVs的舱室.图纸未按比例Fig.2 The electroformation chamber machined from two pieces of ITO electrode，the drawing is not to scale

2.3 制备GUVs

处理ITO 电极：先用无水乙醇超声10 min，再用氯仿／甲醇 （体积比1∶1）溶液超声10min，最后用甲醇淋洗并氮气吹干，置于30℃真空干燥箱中至少2h即可.

分别用氯仿和氯仿／甲醇 （体积比为19∶1）作为溶剂，配制实验用的磷脂成膜液，其中罗丹明含量为0.5mol%.使用涂抹法将2μL 的磷脂溶液均匀涂抹在处理好的ITO 电极上，将其置于真空干燥箱干燥至少2h，以确保膜内有机溶剂完全挥发，使用高纯氮气回填保护.制备GUVs时，先向反应舱室注入0.1mol／L 的蔗糖溶液或超纯水缓冲液，后施加电场，利用显微镜实时观察GUVs的生成过程.

3 结果与讨论

3.1 GUVs的形成和原理

缓冲液注入 （0.1mol／L，蔗糖）后，DMPC：DOPC （1：0.25）干膜浮起呈现云片状，如图3（A）所示.施加AC （2V，10Hz）电场初期，未引起磷脂膜形态的明显变化.当AC 电场持续作用大约2h后，磷脂膜突然出现密集的突起，并膨胀生成一片粒径较小的GUVs，如图3 （B）所示.在电场作用下，GUVs粒径增大，且相邻的GUVs融合，大约10min后GUVs的粒径趋于固定值，如图3 （C）所示.

图3 电制备DMPC：DOPC （1：0.25）GUVs.（A）干磷脂膜显微镜相差图像；（B）施加AC （2V，10 Hz）120min后GUVs的相差图像；（C）130min后GUVs的荧光图像Fig.3 GUVs prepared from DMPC：DOPC （1：0.25）films.（A）Phase-contrast microscopic image of dry phospholipid films.（B）Phase-contrast microscopic image of the first GUVs formed after 120min，and（C）fluorescence microscopic image of GUVs formed after 130min by AC （2V，10Hz）

缓冲液渗入紧密排列的磷脂分子内，使具有亲疏水特性的磷脂分子自组织成磷脂双层重叠排列，宏观表现为膜的浮起增厚，如图4 （A）和（B）所示［11］.此时，磷脂双层膜受水合力、范德华力、渗透压、水层扰动和热扰动等因素的作用.依据磷脂膜形变的基本原理可知，一个或多个因素的变化即可引发磷脂双层曲率的改变［12］.由于磷脂分子头部的电特性，如图1所示.电双性的磷脂分子头部可被视为一对偶极子，在AC 电场中将与电场同频率振动；带电的磷脂分子在电场中将受到静电排斥或吸引.因此，在电制备GUVs时，电场成为诱发和加速磷脂双层形变的又一个重要因素［13］.它促使磷脂双层的分离，并加速磷脂双层的弯曲、出芽和膨胀，如图4 （C）所示.磷脂双层的流动性和相邻的囊泡可融合为GUVs的形成提供了必要条件，如图4 （D）所示.值得注意的是，电场参数固定时，GUVs不会无限膨胀，其粒径终将趋于相对稳定值.

图4 电制备GUVs的原理示意图.（A）干磷脂膜，（B）水化的磷脂膜，（C）膜形变， （D）Δt后生成的GUVS.E（t）代表电场强度，图中箭头指向电场方向Fig.4 The Schematics of electroformation GUVs model for theoretical estimates.（A）dry phospholipid film，（B）hydrated phospholipid film，（C）membrane deformation，（D）generated GUVs after a period of time（Δt）.E（t）represents the electric field intensity，the arrow point electric field direction

实验表明，在0.1mol／L 的蔗糖溶液和超纯水缓冲液中，通过施加AC （10～30 V／cm、3～10Hz）或DC （15 V／cm）控制GUVs的制备.这里列出不同条件下电制备GUVs的统计数据，见表1，对比和分析了各个因素对电制备GUVs的影响.

图5 不同条件下电制备GUVs的平均粒径统计图Fig.5 Statistics showing the average particle diameter of electroformation GUVs under different conditions

3.2 电场对电制备GUVs的影响

电场类型对制备GUVs有影响.同等条件下，例如3.5mg／mL DOTAP氯仿溶液制备的干膜，在超纯水中分别用AC 电场和DC 电场制备GUVs.DC电场仅用10min即可使磷脂膜形变并生成GUVs，90min 后即可获得超大粒径 （＞100 μm）的GUVs，但其形状和稳定性较差，如图6（A）所示.用AC （1.5V，10 Hz）替换DC 后，观察到GUVs壁与AC 电场同频振动，并且形状改善；若增大AC 电压幅值，将出现相邻GUVs融合及粒径较大的GUVs破裂等现象.这说明AC 电场对生成的GUVs有力的作用.此外，从表1和图5可知，DC电场对正电性磷脂的作用比对负电性和电双性磷脂的作用强烈.

表1 电制备GUVs的参数表Table 1 Parameter list of electroformation GUVs

图6 电制备的DOTAP GUVs的显微镜荧光图像DC（1.5V）作用：（A）10min，（B）90minFig.6 The fluorescence microscopic images of DOTAP GUVs formed after 10min（A）and 90min（B）by DC （1.5V）

电场的电压幅值和频率是影响电制备GUVs的主要因素.实验表明，电压越大，电形成过程中致磷脂膜形变所需的时间 （Δt）越短，形成的巨囊泡粒度越宽、形状和稳定性越差；电场频率越低，粘附在磷脂膜上的GUVs的收缩和扩张的频率越明显.通常选用AC （20V／cm、10 Hz）或DC （15V／cm）制备形状相对稳定和粒度分布窄的GUVs.例如0.1 mol／L 蔗糖缓冲液中，DOPC：Ch （1：0.3）GUVs电形成后，若电压不变，则GUVs粒径和数量将保持稳定状态，如图7（A）所示.若电压增大，将出现GUVs膨胀、融合、破裂和脱离表面等现象，GUVs粒径将增大至一个新的稳定状态.当电压幅值≥40 V／cm时，由于膨胀使囊泡壁结构疏松，导致个别粒径较大的GUVs瓦解，如图7 （C）所示.电压幅值从40V／cm 到100V／cm 增大时，粒径小的GUVs不易瓦解，个别GUVs脱离磷脂膜表面，如图7 （D）所示.

图7 电场强度和温度影响DOPC：Ch （1：0.3）GUVs的粒径 分 布 统 计 图.（A）AC （2 V，10 Hz），20℃；（B）AC （2V，10Hz），35℃； （C）AC （4 V，10Hz），35℃；（D）AC （10V，10Hz），35℃.其中对应的插图为相差图像Fig.7 The statistics of particle diameter distribution on DOPC：Ch （1：0.3）GUVs impacted by electric field intensity and temperature.（A）AC （2V，10Hz），20℃；（B）AC （2 V，10 Hz），35℃；（C）AC （4V，10Hz），35℃；（D）AC （10V，10Hz），35℃.The corresponding Illustration is phase-contrast microscopic image

3.3 磷脂膜对电制备GUVs的影响

干磷脂膜的均匀性也是影响GUVs品质的因素之一.缓冲液中，磷脂膜的不均匀区域被认为是磷脂双层碎片堆积而成，由于双层的连续性差，则更易被外力扰动而水化变形［14］.但由于碎片面积的限制，非均匀区域易形成粒径小的GUVs和形状复杂的囊泡，如图8所示.因此，制备出均匀的干磷脂膜对电形成品质好的GUVs至关重要.Estes提出的旋涂法可控制转速制备出一定厚度的均匀磷脂干膜，但此方法操作要求高，样品耗费量多.这里采用操作简单和节省样品的涂抹法，通过控制磷脂溶液的浓度和涂抹量以及溶剂的种类，可制备出均匀的干磷脂膜.由表1和图5的可知，以氯仿／甲醇作为溶剂且浓度稍低的磷脂溶液制备的干膜，电制备出的GUVs粒径大、粒度分布窄且形状规则.这表明，强挥发性的氯仿溶剂易使磷脂溶液快速凝固形成非均匀的膜；含少量甲醇的氯仿磷脂溶液可降低溶剂的挥发速率，利于形成相对均匀的干膜.

磷脂膜组份对电场导致磷脂膜形变所需的时间（Δt）有较大影响.在相同条件下，即同种缓冲溶液、同种溶剂和相同磷脂浓度制备的干磷脂膜，混合组份的磷脂较单组份磷脂更易在短时间内形成粒径较大的GUVs，见表1.由于多组份磷脂膜易相分离，在受到外界干扰时，改变膜曲率更容易.实验显示，有混合磷脂 （如DPPC：DOPC：Ch）在缓冲液（0.1mol／L 蔗糖）注入反应舱室后，表面立刻水化形变，产生小囊泡、形状不规则的GUVs、微管或多室囊泡，如图8（A）所示.施加AC电场15min后，已水化的不均匀区域里原来的GUVs粒径增大且形状改善，并伴有新的GUVs产生；而磷脂膜均匀的区域生出GUVs，如图8 （B）所示.AC 电场作用30 min后即可形成大量窄粒度分部的GUVs，如图8（C）所示.

图8 电场对电制备DPPC：DOPC：Ch （1：1：0.3）GUVs的影响.（A）不施加电场时磷脂膜形态的相差图像；（B）AC （2 V，10 Hz）作用15 min后生成GUVs的相差图像；（C）AC （2 V，10 Hz）作用30min后生成GUVs的荧光图像Fig.8 The influence of electric field on the electroformation of DPPC：DOPC：Ch （1：1：0.3）GUVs.（A）shows phase-contrast microscopic image of phospholipid membrane morphology without electric field；（B）shows phase-contrast microscopic image of GUVs with AC （2 V，10 Hz）after 15min；（C）shows fluorescence microscopic image of GUVs with AC （2 V，10 Hz）after 30min

胆固醇是影响GUVs粒径的因素之一［15］.由于胆固醇可增大磷脂双层的刚性，会使磷脂膜不易形变.在相同的电制备条件下，含有胆固醇的GUVs粒径均比不含胆固醇的要小，如图5所示.

3.4 其它因素对电制备GUVs的影响

实验显示，缓冲液、温度和衬底表面均对电制备GUVs有影响［13，16］.实验统计结果表明，在超纯水中电制备GUVs用时较短 （Δt ≤1.2h），见表1.在无渗透压的超纯水中更易电制备出GUVs，甚至粒径＞200μm，缺点是稳定性差；而蔗糖溶液（0.1 mol／L）具有渗透压（95 mOsm／kg）.换言之，外加电场对磷脂双层间的分离起到了补偿渗透压的作用［17］.有研究表明，生理条件下也可用电制备GUVs，但因为离子强度和渗透压等原因，形成的GUVs粒径很小，约15μm 左右［18，19］.

电制备GUVs时，要求实验温度至少高于磷脂的相转变温度，即磷脂膜处于liquid相或gel／liquid混合相，这利于磷脂双层的形变.对比图7中（A）和 （B），不难看出温度升高利于粒径大的GUVs形成.

衬底特性也会影响干膜的形貌和电形成过程，这里并未做详细的研究.

4 总 结

利用电形成方法制备了不同磷脂种类和不同组份的GUVs，并利用显微镜观测电场参数、磷脂种类和组份、磷脂溶液的浓度和溶剂种类、磷脂干膜的品质以及缓冲液对形成GUVs的影响.结果表明，电场加速了磷脂膜的双层间的分离，电场对溶液的渗透压起到补偿作用.AC 电场比DC电场更有效的调节GUVs的粒径、形状和影响其稳定性；电压增大可使磷脂膜形变时间 （Δt）缩短，GUVs的粒度加宽、形状和稳定性变差；电极表面上吸附的GUVs随AC 电场同频扩张和收缩.适量浓度的氯仿／甲醇磷脂成膜液利于制备出均匀干膜.混合组份的磷脂较单组份磷脂膜形变时间 （Δt）更短；胆固醇可抑制GUVs的粒径.高于磷脂相转变温度时，蔗糖溶液中形成的GUVs粒径较超纯水中形成的小，但形状规则且状态相对稳定.

电制备GUVs法具有简单、可控和利于原位微操作等优点.但也存在两个待解决的技术问题，即GUVs与磷脂膜之间以及GUVs间存在粘连，生理条件下电制备的GUVs的粒径过小.此研究工作为后续在生理条件下电制备悬浮的大粒径GUVs提供了平台.

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