双黄连及清开灵对耐药大肠埃希菌质粒的消除作用及对β-内酰胺酶活性的影响

雷 云

（湖北省武汉科技大学附属天佑医院检验科，武汉 430064）

在临床疾病治疗中，对于抗生素的应用若是不合理，不仅将提高细菌的耐药性，也将给疾病抗感染治疗带来一定挑战；针对β-内酰胺酶 (ESBLs)引起的耐药问题，采用中药抗感染治疗方式，也将会发挥重要作用。以下就对探讨临床中中药双黄连及清开灵对耐药大肠埃希菌质粒的消除作用及对β-内酰胺酶 (ESLs)活性的影响，具体内容如下所示。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用由我院临床送检的痰标本[1]，并筛查大肠埃希菌ESBLs，按照美国临床、实验室 (CLSI/NCCLS)标准进行检验，选取ESBLs阳性的大肠埃希菌。还将应用质粒提取试剂盒 (生产厂家：OMEGA公司，产品型号：D6943-01)，还有Bradford蛋白浓度测定试剂盒 (生产厂家：Solarbio公司，产品型号：Pc0010)，清开灵注射液 (生产厂家：神威药业有限公司，国药准字：Z10930010)，头孢他啶 (生产厂家：齐鲁制药有限公司，国药准字：H20010255)，双黄连粉针剂 (生产厂家：哈药集团中药二厂生产，国药准字：Z20043425)药物。在实验中，应用全自动微生物鉴定药敏分析系统 (生产厂家：美国BD公司，产品型号：PHOENIX100)、凝胶成像仪 (生产厂家：北京兴达恒信科技有限公司，产品型号：Bio-Best)、全波长多功能酶标仪 (生产厂家：欧洲Tecan公司，产品型号：Infinite M1000)、紫外分光光度计 (生产厂家：北京钮因华信科技发展有限公司，产品型号：UV2400)。

1.2 实验方法 试验组中，测定药物最低抑菌浓度，参照肉汤稀释法以肉眼观察无试管中的最低药物浓度值；在质粒消除实验中，将实验菌株转种到含有1/2MIC浓度中药的M-H肉汤中培养24h之后，用生理盐水将其洗涤后重悬浮，并调整OD值浓度到1.0，吸取瓶中5mL的菌液。然后，就可按质粒提取盒上面的操作步骤，对0.01mL质粒溶液进行10倍稀释，并分别在260nm和280nm波长下用紫外分光光度计测量其OD值[2]。将经中药处理后的菌株转种到M-H琼脂培养基上，选取在抗生素培养基上不生长菌株，以及在普通培养基上生长的菌株，并把消除子转种在M-H肉汤中，放在37℃环境中振摇培养；经1%琼脂糖电泳后EB染色，再在紫外凝胶成像仪下分析中药双黄连及清开灵处理前后的质粒消除情况。β-内酰胺酶活性测定中，将获得的菌体用磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤，在4℃环境下重悬在PBS缓冲液中预冷，需要在100W条件下进行超声破碎3min，吸取上清，用Bradford方法进行蛋白定量。观察组中，质粒消除中，选用十二烷基磺酸钠(SDS)做对照实验，用不经处理菌株作空白对照，选用舒巴坦 (30mg/L)检验β-内酰胺酶活性。

1.3 统计学处理 采用SSPS12.0简体中文网络版软件对所有数据进行统计分析[3]，研究所涉及到的计量资料用t检验，计数资料以χ2检验，检验水准P＜0.05为差异具有 “显著”意义；P＞0.05，差异无意义。

2 结果

对于两组试验后，药物MIC测定结果中，双黄连、清开灵对菌株MIC为125mL/L，经双黄连以及清开灵作用后，菌液质粒浓度产生一定的变化，降低质粒浓度，可见双黄连及清开灵对ESBLs大肠埃希菌质粒有消除作用;且在β-内酰胺酶活性测定中，经双黄连及清开灵作用后，细菌β-内酰胺酶活性降低，差异有统计学意义 (P＜0.05)。两组具体数据如下表1中所示。

表1 两组β-内酰胺酶活性对比

3 讨论

近年来，针对ESBLs大肠埃希菌引起耐药问题，提高治疗中人体对敏感菌株的耐药性[4]，并通过特异性整合之后，还可在质粒上使得耐药基因群聚，提升细菌的多重耐药性；并且，在β-内酰胺酶中，还可以通过水解、非水解的方式破坏β-内酰胺环，从而将会灭活青霉素与头孢菌素类抗生素，使患者细菌产生抗药性，使许多抗生素失效。在临床感染性疾病治疗中，作为清热解毒类药物，双黄连与清开灵发挥一定治病疗效作用，不仅可以抑制肺炎双球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌，还具有广谱抗菌作用，同时也具备消除细菌耐药性的潜能。

在动物实验中研究显示，双黄连、清开灵可延长感染体存活时长，减轻患者菌血症症状，减轻感染体的脏器病理损伤，缩短临床治疗病程，有效提高临床治疗效果[5]。应用双黄连、清开灵治疗感染性的疾病，可以抑制大肠埃希菌的协同作用，能够使不敏感细菌转化为敏感菌，消除ES-BLs大肠埃希菌R质粒，抑制β-内酰胺酶活性

临床上，针对耐药ESBLs大肠埃希菌，可以应用中药方式消除细菌耐药质粒，降低耐药性，降低β-内酰胺酶活性。应用中药双黄连与清开灵可以通过抑制外排泵作用，通过天然耐药和获得性耐药两种机制，细菌固有的抵抗抗菌药的能力，对抗菌药产生耐药，改变膜通透性阻滞药物进入，消除质粒，消除细菌耐药性，黄连提取物，还可抑制细菌外排泵作用，恢复外膜通道蛋白表达，抑制细菌耐药质粒。采取双黄连中药，可以清热解毒、清热燥湿，对直接消除质粒，提高了中药消除剂效果具有一定的作用。双黄连中具备中药消除R质粒，以中药黄连提取物作为质粒消除剂，可以消除体外R质粒，提高消除率。其中，清开灵注射剂，对部分革兰阴性杆菌亦具有抗菌活性，是由胆酸、珍珠母 （粉）、猪去氧胆酸、栀子、水牛角 （粉）、板蓝根、黄芩苷和金银花制备的中药复方制剂；具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的功效。

由上可知，临床中，中药双黄连与清开灵可以消除耐药大肠埃希菌质粒，抑制β-内酰胺酶活性，相较于常规西医方法，具有很好的临床效果，值得推广。

[1]何明，吴峥嵘，李渊.双黄连、清开灵对耐药大肠埃希菌R质粒及β-内酰胺酶的影响[J].北京中医药大学学报，2012，(2)，pp.105-108.

[2]曹颖.双黄连及清开灵对产ESBLs大肠埃希菌抑菌作用的研究[D].北京：北京中医药大学，2011.

[3]吴峥嵘.双黄连粉针剂对多重耐药大肠埃希菌耐药性影响的机理研究[D].北京：北京中医药大学，2013.

[4]张志坚.河南地区大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的研究[D].郑州：郑州大学，2010.

[5]张春辉.致病性大肠埃希菌ESBLs基因检测与耐药性控制[D].西安：西北农林科技大学，2011.