BMECs经TCM和ACM条件培养Caveolin-1的表达对比及其机制的探讨

裴 亮 雷 鸣 姚长义 王义宝

（1.辽宁省沈阳市第一人民医院神经外科，110041；2.中国医科大学附属第一医院神经外科）

·基础研究·

BMECs经TCM和ACM条件培养Caveolin-1的表达对比及其机制的探讨

裴 亮1雷 鸣1姚长义2王义宝2

（1.辽宁省沈阳市第一人民医院神经外科，110041；2.中国医科大学附属第一医院神经外科）

目的 探讨Caveolin-1在大鼠C6胶质瘤细胞件培养液（TCM）和星形胶质细胞条件培养液（ACM）条件培养对脑血管内皮细胞（BMECs）表达的关系。方法 对BMECs进行原代培养，以TCM进行培养，以ACM进行培养作为对照，进行免疫荧光染色和Western blot检测Caveolin-1表达情况。结果 免疫荧光显示BMECs中Caveolin-1的表达定位于细胞浆，实验组染色强度高于对照组；Western blot蛋白测定结果显示实验组的IDV灰度值为60 831±2 865.197，明显高于对照组的IDV灰度值18 645±3 607.659，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 Caveolin-1在TCM培养BMECs细胞中高表达，验证了组织微环境改变可以引起周围血管内皮细胞表型改变这一假设，为胶质瘤靶向治疗载体的选择上提供了一定的理论依据。

Caveolin-1；大鼠C6胶质瘤细胞件培养液；星形胶质细胞条件培养液；脑血管内皮细胞；胶质瘤

脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，由于血肿瘤屏障的存在，化疗药物被限制进入肿瘤组织[1]122-129，而选择性开放血脑肿瘤屏障能够有效增加化疗药物在脑胶质瘤组织中的浓度，对脑胶质瘤的治疗具有十分重要的意义。Caveolin-1是 Caveolae的标志性蛋白，分子质量为21～24 kDa，修饰于Caveolae的内表面，是质膜微囊的结构蛋白和最好的生物标记物。本研究通过制备大鼠C6胶质瘤细胞条件培养液（TCM）和星形细胞培养液条件培养（ACM）的脑微血管内皮细胞（BMECs），再通过免疫荧光和Western blot检测BMECs的Caveolin-1的表达，从而探究TCM和ACM不同条件培养对BMECs种Caveolin-1表达的影响，以进一步影响血脑屏障的通透性，为进一步开发新型高选择性靶向性的胶质瘤化疗药物载体提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 II型胶原酶(Sigma)、葡聚糖(Serva)、DMEM培养液(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、胎牛血清(TBD)、TritonX-100(Sigma)、Caveolin-1单克隆抗体(Santa Cruz)、兔抗Caveolin-1多克隆抗体(Santa Cruz)、抗小鼠免疫球蛋白和辣根过氧化酶（北京中山生物技术公司）、FITC-抗兔（北京中山生物技术公司）、Wistar胎大鼠（1周内，中国医科大学实验动物中心）。

1.2 方法 对脑微血管内皮细胞进行原代培养。实验组以TCM培养液进行培养，对照组以TCM培养液进行培养。分别对实验组和对照组中的培养细胞进行Caveolin-1的免疫荧光染色。荧光显微镜观察，采集图像。Western blot检测Caveolin-1表达和分布。结果用Chemi Imager 5500 V2.03软件扫描，Fluro Chen2.0软件定量分析显色条带的IDV数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0，所有数据以均数±标准差表示，两组间采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 免疫荧光显示法检测BMECs中Caveolin-1的表达 实验组高于对照组。见图1。

2.2 Western blot检测Caveolin-1表达和分布 在Western blot蛋白测定的条带上见实验组以TCM进行培养的BMECs中Caveolin-1的表达要明显高于对照组。IDV灰度值测定后统计分析P＜0.05，具有统计学意义。见图2、表1和图3（封三）。

3 讨论

3.1 Caveolae与Caveolin-1 有研究发现增量调节Caveolin-1蛋白能够提高CRM197介导的血脑屏障的通透性[2]，如果转运到肿瘤组织的化疗药物浓度增加2倍，其杀伤肿瘤的能力将提高10倍[3]。近年来的研究证实，大多数哺乳动物细胞特别是内皮细胞的细胞质膜均存在烧瓶状的内陷微区结构，即质膜微囊（Caveolae），它们富含鞘脂和胆固醇，此区域与细胞间黏着结合和紧密连接密切相关[4]，质膜微囊被认为与细胞的吞饮作用及物质的跨膜转运等功能密切相关，它参与许多细胞生命活动。Caveolin-1是Caveolae的标志性蛋白，分子质量为21～24 kDa，修饰于Caveolae的内表面，是质膜微囊的结构蛋白和最好的生物标记物。近年来的研究发现，Caveolin-1与肿瘤细胞的侵袭、转移以及信号传导相关。本实验通过免疫荧光观察和Western blot蛋白测定发现BMECs中的Caveolin-1在TCM液培养后表达明显高于ACM培养后的表达，如利用Caveolin-1在脑瘤屏障中高表达是否能制造出特异性高，能选择性开放血肿瘤屏障的靶点为开发临床新型高选择性开放血肿瘤屏障药物提供理论支持。但是需要注意的是某些因素如N-乙酰半胱氨酸的缺乏和绿茶多酚能够降低Caveolin-1的表达和血脑屏障作用的减弱[5]。本研究发现在TCM培养下的血管内皮细胞Caveolin-1表达上调，而有利于促进血肿瘤屏障的开放。一方面可以通过此途径进行化疗，提高化疗药物的使用效率，另一方面由于血肿瘤屏障的开放，肿瘤的扩散和转移，浸润到正常组织中更加容易，亦能够解释研究发现与肿瘤的转移和浸润有关的原因。故上调或降低Caveolin-1的表达是个双刃剑，需要更进一步的研究证实。

表1 ACM和TCM 培养BMEC中Caveolin-1的Western blot的数据

3.2 TCM、ACM与BMECs 胶质瘤组织中的血肿瘤屏障与正常脑组织的血脑屏障在结构和功能上存在着很大差异，目前胶质瘤脑血管内皮细胞与正常脑血管内皮细胞之间的血脑屏障特性差异的分子机制还不清楚。但胶质瘤脑血管超微结构的研究发现微血管内皮之间紧密连接出现异常[6]。紧密连接由一组分子所构成，包括oc-cludin和连接粘附分子等。国外学者通过比较蛋白质组学的研究发现肺癌周围的微血管内皮细胞高度表达某些特异性蛋白，而这些蛋白大多参与内陷微区的构成[1]122-129，此研究结果进一步验证了组织微环境改变可以引起周围血管内皮细胞表型改变这一假设。前期抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)实验结果显示胶质瘤微血管段存在着特异性的mRNA表达，提示胶质瘤微环境很可能引起附近脑血管内皮细胞的表型变化，进而影响脑血管内皮细胞表达血脑屏障的特性。本研究通过TCM培养和ACM培养的BMECs，通过免疫荧光标记和Western blot蛋白测定Caveolin-1的表达，进一步证明了BMECs胶质瘤中高表达。

3.3 TCM对BEMCs转运功能的影响 肿瘤微环境是指肿瘤细胞赖以生存，并对其生命活动产生影响和作用的所有外界环境的总称。如果肿瘤在没有足够的氧气和营养物质的微环境中，肿瘤只能长到几立方毫米，为了向外扩展肿瘤必须通过血管生成获取氧气和营养。肿瘤细胞在肿瘤发生早期即促进血管生成。因此胶质瘤表现为高度血管化，并且微血管与正常血脑屏障不同，胶质瘤脑血管超微结构的研究发现微血管内皮之间紧密连接出现异常。Zhong Y发现Caveolin-1能够调节HIV-1介导紧密连接蛋白表达的改变[7]。大量研究结果从不同方面充分证明了形成血脑屏障并非脑血管内皮细胞固有的内在特性，而是由于星形胶质细胞的诱导作用所致[8-9]。鉴于星形胶质细胞存在诱导并维持脑血管内皮细胞形成血脑屏障的作用，胶质瘤微环境对脑血管内皮血脑屏障的影响可能更为复杂[10]，我们的体外试验显示TCM条件培养可以明显增加脑微血管内皮细胞上Caveolin-1的表达以及质膜微囊的数量，并且TCM条件培养可以提高小剂量缓激肽作用后BMECs对大分子物质的通透性。结合Fisher等[11]的研究结果我们推测，虽然TCM不能直接增加BMECs上紧密连接的通透性，但是极可能影响BMECs上转运功能相关区域，特别是质膜微囊的表达，从而在某种程度上提高了血肿瘤屏障的可调控幅度，这为选择性开放血肿瘤屏障提供了可能的靶点。虽然质膜微囊不直接参与细胞间紧密连接的形成，但是实验表明上皮细胞系紧密连接相关蛋白的解体、吞饮、再分布以及重新聚合同质膜微囊有着密切的关系。

4 结论

TCM和ACM培养细胞进行免疫荧光观察和Western blot检测，Caveolin-1在TCM培养BMECs细胞中高表达。说明在胶质瘤微环境中BMECs中Caveolin-1高表达，从而验证了组织微环境改变可以引起周围血管内皮细胞表型改变这一假设，对为进一步开发新型高选择性靶向性的胶质瘤化疗药物载体提供理论依据。

[1] Zhao LN. Vascular Endothelial Growth Factor Increases Permeability of the Blood-Tumor Barrier via Caveolae-Mediated Transcellular Pathway[J]. J Mol Neurosci, 2010, 44(2).

[2] Wang P, Liu Y, Shang X, Xue Y. CRM197-induced blood-brain barrier permeability increase is mediated by upregulation of Caveolin-1 protein[J]. J Mol Neurosci, 2011, 43(3): 485-492.

[3] Liu LB, Xue YX, Liu YH. Bradykinin increases the permeability of the blood-tumor barrier by the caveolaemediated transcellular pathway[J]. J Neurooncol, 2010, 99(2): 187-194.

[4] Song L, Ge S, Pachter JS. Caveolin-1 regulates expression of junction-associated proteins in brain microvascular endothelial cells[J]. Blood, 2007, 109(4): 1515-1523.

[5] Beauchesne E, Desjardins P, Butterworth RF, Hazell AS. Up-regulation of Caveolin-1 and blood-brain barrier breakdown are attenuated by N-acetylcysteine in thiamine deficiency[J]. Neurochem Int, 2010, 57(7): 830-837.

[6] Davies SC. Blood-brain barrier breakdown in septicencephalopathy and brain tumours[J]. J Anat, 2002, 200(6): 639-646.

[7] Zhong Y, Smart EJ, Weksler B, et al. Caveolin-1 regulates human immunodeficiency virus-1 induced alterations of tight junction protein expression via modulation of the Ras signaling[J]. J Neurosci, 2008, 28(31): 7788-7796.

[8] Fitsanakis VA, Piccola G, Aschner JL, et al. Manganese transport by rat brain endothelial (RBE4) cell-based transwell model in the presence of astrocyte conditioned media[J]. J Neurosci Res, 2005, 81(2): 235-243.

[9] Haseloff RF, Blasig IE, Bauer HC, et al. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro[J]. Cell Mol Neurobiol, 2005, 25(1): 25-39.

[10] Neuhaus W, Lauer R, Oelzant S, et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2[J]. J Biotechnol, 2006, 125(1): 127-141.

[11] Fischer S, Wobben M, Kleinstuck J, et al. Effect of astroglial cells on hypoxia-induced permeability in PBMEC cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2000, 279(4): 935-944.

R65

A

1672-7185（2014）04-0056-03

10.3969/j.issn.1672-7185.2014.04.033

姚长义

2013-11-29）