草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)VP6相互作用蛋白的筛选*

丁 燏 李 杰 闫秀英 简纪常① 吴灶和

(1. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 广东海洋大学水产学院 湛江 524025;2. 仲恺农业工程学院 广州 510000)

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病是草鱼的主要病害之一, 广泛流行于我国鱼类主产区域。它是我国第一例鱼类病毒性疾病, 与其相关的研究也最为深入, 历史最为悠久。该病的病原为草鱼呼肠孤病毒(GCRV), 是水生呼肠孤病毒属的C亚型, 且是该属中毒力最强的病毒株型, 因此具有较高的感染率、流行率、致死率、发病季节多等特点(Rangelet al,1999; 迟妍妍等, 2011; Tianet al, 2013)。除了感染草鱼外, 还能感染鲢、稀有鲫、青鱼、麦穗鱼等鱼类。GCRV基因组编码产物计12种, 其中结构蛋白7种(VP1—VP7), 非结构蛋白5种; 结构蛋白中除了VP2与VP4之外, 其它均是病毒双层衣壳的蛋白组分(Ivanovicet al, 2007; Caiet al, 2011)。而VP6是该病毒粒子内层衣壳的成分, 能够联系内外两层衣壳, 在病毒核酸的复制、转录及病毒装配过程中起着较重要的作用, 与哺乳动物呼肠孤病毒中δ2蛋白的功能相似(肖波, 2010)。VP6由基因S8编码, 含有氨基酸残基412个, 大小为44.6 kDa左右。目前国内大多数学者仅关注该蛋白的免疫原性、重组表达、疫苗研制等,对其相互作用蛋白的研究还未引起足够的重视(孟思妤等, 2010; 郭帅等, 2010; 周勇等, 2011), 在一定程度上, 阻碍了该病毒的致病机制、预防性疫苗等研究工作的深入开展。

基因的作用最终是靠其翻译表达的蛋白质来实现的, 而不同蛋白之间的相互作用对其功能的发挥具有重要的意义, 因此了解蛋白质之间的作用是掌握基因及其蛋白功能的一种重要途径, 已成为各领域研究的热点问题。常用的蛋白质研究方法包括噬菌体表面展示技术、酵母双杂交系统、GST标记的pull-down技术、免疫共沉淀法、质谱鉴定、病毒铺覆蛋白印迹技术、基于生物信息学的分析方法等。其中酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)可以直接在体内或胞内分析蛋白质相互作用, 到目前为止该技术平台已广泛应用于各领域以检测蛋白与蛋白之间的相互作用(Fieldet al, 1989)。对病毒而言, 其相互作用蛋白很有可能是其在宿主细胞上相应的受体,而病毒受体是病毒侵染宿主细胞的决定因素之一(Marret al, 2013), 病毒受体的鉴定及其与病毒蛋白的相互作用过程与机制的阐明对病毒感染机制分析具有重要作用。GCRV相互作用的蛋白的研究极少,通过相互作用蛋白的筛选与鉴定是研究其致病机理的一种重要途径, 本研究采用GCRV 096株的VP6蛋白作为诱饵蛋白, 通过酵母双杂交技术筛选与其相互作用的蛋白, 为进一步确定GCRV在侵染宿主过程中VP6的地位打下良好基础, 为进一步阐明GCRV的致病机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

GCRV 096株、草鱼肾脏组织细胞系(CIK), 由本实验室保存。

质粒pGEX-KG购自北京鼎国生物公司, 克隆质粒pGBKT7 DNA-BD、pGADT7 AD等和对照质粒pGBKT7-53、pGADT7-T等, 以及酵母菌株(Y2Hgold和Y187)均购自Clontech公司, E.coli DH5α由本实验室保存。

dNTP 、ExTaq酶、T4DNA连接酶、DNA Marker等试剂, 及MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒, 限制性内切酶均购自TaKaRa公司。

反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM(TransGen公司); QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN公司);UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒与酵母质粒小量抽提试剂盒, 实验中所用的引物(上海生工生物工程有限公司); 质粒提取试剂盒(U-gene公司)。

MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、Yeastmaker Yeast Transformation System 2、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library system试剂盒、酵母菌培养所用各种培养基及Advantage 2 Polymerase Mix均购自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 利用软件Primer Premier_5.0设计引物以扩增GCRV096 VP6基因, 其序列为: F:5′-CGCGGATCCATGGCACAGCGTCAGTT-3′ (BamH I)和R:5′-ACGCGT CGACTTAGACGAACATCACC-3′(SaII)。

1.2.2 GCRV VP6诱饵载体的构建 用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒提取GCRV总RNA, 再以此为模板合成cDNA的第一条链(采用反转录试剂盒), 然后对VP6基因用PCR法进行扩增。PCR反应体系与反应参数参照李杰等(2013)的方法。同样按照李杰等(2013)的方法完成PCR产物的回收、产物和诱饵载体的连接、重组质粒的转化、诱饵重组质粒的鉴定等。

pGBKT7-VP6的自激活作用检测与毒性检测参照YeastmakerTMYeast Transformation System 2操作手册与李杰等(2013)的方法进行。

1.2.3 VP6相互作用蛋白的筛选 相互作用蛋白的筛选鉴定参照李杰等(2013)的方法进行, 包括诱饵菌的筛选和纯化、诱饵菌与文库菌的体外融合、接合子的显微观察、克隆数的统计计算、结合效率的确定、阳性克隆的鉴定与测序分析等过程。其中CIK cDNA文库(>2.0×107cfu/mL)由本课题组前期工作中所构建。

2 结果

2.1 pGBKT7-VP6诱饵质粒

将VP6基因PCR产物与克隆质粒pGBKT7分别进行双酶切, 然后用T4连接酶连接构建诱饵质粒pGBKT7-VP6, 经双酶切后电泳分析与菌落PCR分析鉴定, 相应大小的PCR产物克隆成功(图1), 且序列测定结果完全吻合。其中图1a为菌落PCR的结果,说明其基因已存在于细菌的质粒之中; 图1b为双酶切分析结果, 与预期的片段大小、插入位点相符。可见, 所需的诱饵质粒pGBKT7-VP6构建成功, 为VP6相互作用蛋白的筛选提供了可靠的质粒。

图1 VP6基因菌落PCR检测与pGBKY7-VP6双酶切鉴定结果Fig.1 Results of colony PCR analysis of VP6 gene and AGE analysis of pGBKT7-VP6 digested with BamH I and Sal I

2.2 pGBKT7-VP6自激活作用检测和毒性检测

在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/Kan培养基上, 含有pGBKT7-VP6的转化菌生长良好, 但在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上未见其生长, 排除了诱饵蛋白的自激活特性。含有pGBKT7-VP6的转化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板培养基上生长一切正常, 且在液体培养基(SD/-Trp/Kan)中振荡培养后, OD600大于0.8, 可见诱饵蛋白并无毒性。该结果保证了进一步进行相互作用蛋白筛选试验的可行性。

2.3 VP6相互作用蛋白的筛选

酵母CIK文库菌与VP6钓饵菌相互配合, 在显微镜下观察发现已形成了明显的三叶草型结构(图2),示2个大球形的亲代单倍体细胞与1个正在出芽小球形的二倍体细胞。说明形成了有效的接合子, 可以进行下一步的实验, 即将其接种于不同培养基以确定筛选克隆数。筛选克隆数(cfu/mL)的获得是经各培养基中平板菌落数的统计来完成的; VP6试验组在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu等三种不同选择培养基中的筛选克隆数依次为5.16×107、3.31×106、1×105cfu/mL,而阳性对照组在三种培养基中的筛选克隆数依次为7.84×107、6.63×106、3.2×105cfu/mL (表1)。经公式: 融合效率 = 二倍体克隆数(或培养基SD/-Trp/-Leu中的克隆数)/另两种培养基中克隆数相比较小的值, 可以计算出VP6、对照组的融合效率分别为3.02%、4.83%,介于2%—5%之间, 完全满足进一步试验的基本要求。经高筛选培养基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA反复对融合产物(即SD/-Trp/-Leu/ X-α-Gal/AbA平板上的蓝色克隆)进行多次筛选确定, 通过共转化酵母菌Y2HGold等方法验证它们之间的相互作用, 最后共获得4株可能的阳性克隆(呈蓝色、圆形的单菌落)(图3)。

图2 酵母融合子的形态Fig.2 Form of the fused yeasts

表1 筛选克隆数结果(cfu/mL)Tab.1 Number of screened clones on the selective medium(cfu/mL)

图3 融合酵母的筛选结果Fig.3 Screening result of yeast zygote on the medium ofSD/-Trp/-Leu/ -Ade/-His/X-α-Gal/AbA

对获得的4株待定阳性克隆文库质粒插入片段分别送至上海生工生物工程有限公司进行测序, 经序列分析与碱基校正后, 发现它们分别属于两条不同的基因序列, 其有效序列长度分别为470bp和807bp。利用GenBank数据库进行同源性比对分析所得序列的结果表明, 一条序列对应的蛋白质序列与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)呈高度同源, 其同源性为99%, 这种蛋白极可能就是3-磷酸甘油醛脱氢酶; 而另一条蛋白质序列暂时并没找到其相应的同源性蛋白, 可能是一种未知蛋白。

3 讨论

酵母双杂交技术是一种筛选和鉴定相互作用蛋白的有效手段, 不同于噬菌体展示技术、免疫印迹技术、质谱分析技术、基于生物信息学的蛋白分析技术等蛋白质研究方法, 它集分子克隆技术、克隆文库技术、蛋白质研究技术与方法于一体, 对实验者的实际操作能力与分子生物学基础理论的要求较高。通过熟练操作, 经它筛选得到的蛋白, 一般而言与该蛋白功能的发挥密切相关, 它们往往通过在胞内的相互作用相互调节, 共同参与某一复杂的生理病理过程。因此, 该技术是蛋白质功能研究的有效手段之一, 有助于人们理解基因通过蛋白作用的分子机制。对病毒而言, 筛选的相互作用蛋白可能是其受体蛋白或其部分功能域, 也可能是在病毒增殖程中除了结构蛋白之外其它相关的蛋白质, 因此在一定程度上, 筛选、鉴定其相互作用蛋白的难度明显增加了(Fieldet al,1989)。本研究中在项目组已建立CIK cDNA文库的基础上, 充分利用酵母二倍体细胞来进行CIK cDNA文库筛选的方法, 有效地克服了诱饵质粒与文库质粒共转化酵母菌效率低等技术瓶颈问题(Fieldet al,1989); 在高效选择培养基上反复筛选得到的阳性结果, 对含有多种cDNA插入片段的融合菌株进行了有效的淘汰, 保证了克隆的均质性、有效性(Fieldet al,1989)。本文的结果也表明在GCRV相互作用蛋白的筛选中酵母双杂交技术的高效性与可行性, 该技术在GCRV相互作用蛋白方面具有较好的应用价值与借鉴意义, 为呼肠孤病毒属中其它各病毒的功能研究提供了新的途径与方法。

在草鱼呼肠孤病毒粒子双层衣壳中, VP6蛋白是一种典型的夹合蛋白, 具有联系GCRV病毒粒子的内外衣壳、稳定内层衣壳骨架分子VP3的作用, 还可能与病毒粒子表面的突起物也同样存在一定的相互作用(Chenget al, 2008)。已有研究表明VP6在GCRV基因的转录、复制, 及病毒粒子的装配中有着重要的地位(方勤, 2005), 还发现VP6蛋白对dsRNA有一定的结合能力, 但对其相互作用蛋白尚未进行深究。本研究中, 经酵母双杂交技术获得VP6的两种相互作用蛋白, 并通过共转化试验进一步验证了它们之间的相互作用。在得到的两种相互作用蛋白质中, 其中一种与GAPDH的同源性高达99%, 可见其为GAPDH的可能性较大, 这是在GCRV与宿主相互作用过程中新发现的一种相互作用蛋白。GAPDH是糖酵解反应中一个重要的代谢酶, 此外它还会参与转录激活、细胞凋亡的启动等非代谢生理过程(方勤, 2005; Tarzeet al, 2007; Marret al, 2013; Zinsseret al, 2014)。作为VP6的一种相互作用蛋白, GAPDH在GCRV侵染过程中极可能参与了宿主的代谢调控, 或参与转录调控、细胞凋亡的启动调节等过程。但其具体的机制还有待后续研究深入的阐明, 此外这种相互作用与VP6作为夹合蛋白间的联系, 以及这种相互作用与病毒表面突起物间作用的关联性都值得作更深入的探讨。而另一种相互作用蛋白尚属未知蛋白, 加强对其鉴定及其功能研究可能会有更多的发现, 极可能是对GCRV致病机理研究的一个突破。尽管对未知蛋白的研究困难重重, 在后续研究中一定要重视对它的研究, 以获取更多的病毒致病机制的相关信息。总之,本研究为进一步探讨VP6的生物学功能以及GCRV的侵染机制指明了一定的方向, 该蛋白的结构与功能、相互作用的分子机制及其调节机理等研究工作需要更加深入进行。

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