马立克疫苗的质量检测及其对鸡源食品安全的影响分析

薛墨庸 程合刚 （山东农业大学 山东 泰安 271018）

马立克病(marek′s disease，mD)是由疱疹病毒科、细胞结合性马立克病病毒(marek′sdisease virus，mDV)引起的一种高度接触传染性、淋巴组织增生性肿瘤疾病。该病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病，因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。目前，还没有有效的方法来治疗mD患鸡，仍通过疫苗预防控制该病的发生。mD疫苗CVI988/Rispens株仍然是控制mD感染的主要疫苗之一，可有效控制预防超强毒力mDV(vvmDV)和超超强毒力mDV(vv+mDV)[1]。该疫苗对生产、运输和贮存的要求条件较高，任何一个环节出现问题对疫苗的质量都会造成一定的影响。其中疫苗毒力的大小和有无外源病毒的污染是衡量疫苗质量的两个重要指标，疫苗毒力过有可能对鸡群形成有效保护力不够，有外源病毒如禽白血病病毒(ALV)的污染则会引入场外病毒，任何一个方面的不达标则极易造成不同程度的经济损失。本研究检测的外源病毒之一的ALV，属于反转录病毒科、а反转录病毒属，引起禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的肿瘤性疾病。ALV的感染还可引起鸡群的免疫抑制和生产力的严重下降[2,3]。根据致病性和感染宿主的不同，ALV被划分为A-J 10个亚群，外源性病毒J亚型ALV(ALV-J)是目前我国地方品种鸡群中主要的流行亚型，A、B亚型也很常见。内源性E亚群(ALV-E)为整合在鸡染色体中一种前病毒DNA，在鸡群中普遍存在，致瘤性很低，不能产生感染性病毒粒子[4]，但内外源性ALV的重组将导致高致病性毒株的产生[5]。

食品安全是指对食品按其预期用途进行制作、食用时不会使消费者健康受到损害的一种保证。食品安全可追溯到食品加工业的上游，可谓抓安全性必然从源头抓起，源头有很多种，其中畜牧养殖业就是食品源头的重要一环，例如加强动物疫病的防疫，杜绝有害的饲料添加剂等，由此疫苗行业也值得更多的关注。

本研究对山东某种鸡场送检的某国外疫苗公司生产的CVI988/Rispens株mD疫苗进行毒力测定和ALV是否污染的检测，通过评估该类疫苗的质量水平，探究该种鸡场发生疑似mD的可能因素，以此为例探讨了mD疫苗质量对鸡群及至对鸡源食品安全生产的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 山东某种鸡场送检的不同时间生产的两个批次的CVI988/Rispens株mD疫苗编号为F11、F21、F22，批号依次为C006311、C006111、C006311，规格均为2000羽，运输过程中保存于液氮。

1.2 主要仪器和试剂 蛋白酶K购自华美生物工程公司；PCR Kit、DNA marker DL2000、rTaqE(5U/μl)、dNTPs、pmD18-T均购自TaKaRa公司；感受态细胞Trans-T1购自北京全式金公司；胶回收试剂盒购自美国OmEGA公司；DmEm培养基和新生牛血清购自GIBCO公司；胰酶购自德国mERCK公；SPF鸡胚来自济南赛斯家禽科技有限公司；ELISA检测ALV p27抗原试剂盒来自IDEXX，编号为09254-AJ944(抗原)。其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3 mD疫苗的毒力测定 所有疫苗融化后取100ul疫苗液，按照有限稀释法进行测定。每天观察并记录蚀斑的数量，直到蚀斑数量稳定不变，共观察7d。用Reedmuench方法计算疫苗的毒力。

1.4 mD疫苗中ALV p27抗原的ELISA检测 将剩余疫苗置于-80℃冰箱和室温反复冻融3次，以裂解mDV。从裂解后的mD疫苗原液中取150ul，2000rpm，2min离心后取上清用ELISA试剂盒检测上清中的p27抗原，所有样品各设3个重复(大于S/P临界值0.2的样品为阳性)。

1.5 mD疫苗细胞培养后ALV p27抗原的ELISA检测 将处理的疫苗上清接种CEF，2h后，将细胞生长液换为细胞生长维持液，培养9d后检测细胞上清中的ALV p27抗原。同时设置未接种样品的CEF为对照。所有样品各设三个重复。

1.6 mD疫苗细胞培养后ALV的PCR检测 将接毒培养9d后的CEF收集到1.5ml的离心管中，2000rpm，2min离心，弃上清，沉淀用组织抽提液重悬，加入10ul蛋白酶K，55℃消化8h，用苯酚氯仿法提取细胞DNA,用针对ALV-J的gp85基因(924 bp)[6]引物(简写为ALV-J-gp85)和针对A-J囊膜蛋白基因(env)(2400bp，含LTR序列)引物(简写为ALV-ALL)做PCR检测(见表1)。反应体系为25ul。ALV-Jgp85反应程序：94℃预变性8min，94℃变性45sec、60℃退火45sec、72℃延伸1min(30个循环)，72℃总延伸10 min，4℃保存。env基因反应程序为：95℃预变性5min、95℃变性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min30sec(30个循环)，72℃总延伸10min，4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，将阳性产物回收、连接、转化的克隆产物验证成功后送上海铂尚生物工程公司测序。用DNAstar软件对基因进行分析。

表1 ALV鉴别诊断引物

2 结果

2.1 mD疫苗的毒力测定结果 疫苗F11、F21、F22的毒力分别为800PFU/羽份、1300 PFU/羽份、1480PFU/羽份，均低于国家兽医药典规定的2000PFU/羽份，F11低于OIE规定的不低于1000 PFU/羽份的要求。

2.2 mD疫苗原液ALV p27抗原检测结果 mD疫苗F11、F21、F22冻融后上清中p27抗原均为阳性，S/P值分别为0.417、0.43、0.256。

2.3 mD疫苗细胞培养上清中ALV p27抗原的ELISA检测结果 F11、F21、F22细胞上清ALV p27抗原均为阳性，S/P值分别为0.657、0.733、0.774。未接种样品的对照用CEF检测结果为阴性。

2.4 mD疫苗细胞培养后ALV的PCR扩增与测序结果 将得到的F11、F21、F22囊膜蛋白(env)基因序列(PCR方法扩增2400bp片段，包括LTR序列)与参考株mAV-1(A)、RAV-1(A)、RSV-SchmidtRuppin(B)、RSVPr-C(C)、D10652R SV-D(D)、RAV-0(E)、SD0501(E)、HPRS-103(J)、ADOL-7501(J)序列进行同源性分析，结果显示，3瓶疫苗中扩增的ALV序列与参考毒株SD0501(E)、E-strain-1同源性均为98%以上(表2)，遗传进化树分析结果表明，疫苗中污染的ALV与ALV-E参考株SD0501的亲缘关系最接近，说明分离到的毒株属于ALV-E(附图)。J亚型检测结果为阴性。

表2 mD疫苗中污染的ALV株与国内外参考株的核苷酸序列同源性比较(%)

附图 mD疫苗样品中污染的ALV株与不同参考株的遗传进化树关系

3 讨论

（1）养殖生产中经常发生一些不明原因的免疫失败现象，给企业造成重大的经济损失。除了免疫程序、母源抗体干扰、病毒持续感染等因素外，疫苗质量下降、活疫苗遭受外源病毒污染的现象也屡见不鲜。由各种原因导致的mD疫苗保护效力不足，会导致鸡群免疫失败，不能控制和防止鸡群中mD的出现。Silva等利用PCR方法对商品mD疫苗进行检测时，发现了ALV的污染[7]。受污染疫苗的使用会加重该疫病的传播，放大并严重危害养禽业的健康发展。种鸡场出现mD的鸡只不一定是疫苗质量的问题，与疫苗本身的免疫保护指数，注射部位，免疫程序等有一定关系。（2）本研究结果显示，送检的3瓶mD疫苗的免疫剂量均低于国家兽医药典规定的2000PFU/羽份，但有2个批次(F21，F22)满足OIE规定的不少于1000PFU/羽份的要求，疫苗质量和生产状况等还需进一步的提高。检疫部门也应加大ALV的检测力度，提高检出率，确保在生产疫苗过程的细胞培养等阶段无ALV的感染，在生产中完成有无ALV污染的检测。送检疫苗的种鸡场发生mD，无论何种原因所致，但显然，不合格mD疫苗的应用是鸡群发生mD肿瘤病的原因之一。而发生肿瘤的鸡群往往存在抗生素药量超标及滥用问题，影响禽蛋肉等鸡源食品质量，危害人民群众的生活健康。（3）近年来食品安全事件频发，如2012发生的过量药物喂养的抗生素鸡，以及一直不断发生的、禽流感和猪蓝耳病等，动物疫病一直在威胁着食品安全。随着人民生活水平的提高，对农产品质量要求更高，不仅要吃好，而且要吃出健康。食品安全的问题一直是国家和公民所关注的头等大事。随着强制免疫品种的扩大，规模化养殖程度的提高，疫苗市场的规模还有很大的提升空间；随着民众对食品安全事件的关注度提高，国家将继续加大对全国制售假兽药、违法添加违禁药物的力度。而这些都 与生产源头的鸡苗质量与疫苗质量密切相关。

[1]李爵, 史继胜.鸡马利克氏病CV1988疫苗应用效果观察[J].中国家禽, 2004, 26(4): 24-25.

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[3]Gavora J S, Spencer J L, Gowe R S, et al.Harris.Lymphois leukosis virus infection:effects on production and mortality and consequences in selection for high egg production[J].Poult Sci, 1980, 59:2165-2178.

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[6]代阳, 杨其峰, 王波等.不同地区海兰褐蛋鸡中J亚群-禽白血病病毒株株gp85基因的分子演化分析[J].畜牧兽医学报, 2010, 41(5):635-638.

[7]Robert E SiIva，AB Aly m．Fadly,A，Scott P.Taylor．Development of a Polymerase Chain Reaction to Di-ffemnfiate Avian Leukosis virus(ALV)Subgroups：Detection of all ALV Contaminant in Commercial marek’s DiseaseVaccines, 2007.51: 663-667.