MSCs 上清可减轻雷公藤甲素对KGN 细胞的损伤作用①

周 雪 赵光锋 陈士雯 侯亚义 (南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室，南京 210093)

雷公藤在治疗免疫性疾病和炎性疾病的过程中可对生殖系统产生副作用，引起女性的月经周期紊乱以及闭经［1］，甚至可能对卵巢造成不可逆性损害［2，3］，激素疗法虽能回复部分女性卵巢功能，但对某些病例不起作用［2］，且激素疗法会增加血栓、卵巢癌和乳腺癌的风险［4，5］。有研究提示，雷公藤可造成卵泡颗粒细胞层变薄，影响卵泡发育［6-8］。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分［9］，对女性卵巢颗粒细胞的损害及作用机制尚不详，且无改善这种损害的策略。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有免疫抑制和免疫调节功能［10］，目前已逐渐用于自身免疫性疾病、炎性疾病及组织修复治疗的研究［11］。有研究报道，MSCs 能够分泌多种生长因子和细胞因子，改善卵巢蛋白及环磷酰胺等诱导的卵巢损伤［12-14］。但目前对于MSCs 的培养上清是否能改善雷公藤引起的卵巢颗粒细胞损伤尚未有研究。因此，本研究探讨了MSCs 上清对雷公藤甲素损害人的卵巢颗粒细胞系KGN 的作用及其机制，试图提出改善雷公藤甲素损害卵巢的策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料 正常足月健康新生儿的新鲜脐带取自于南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科，均经产妇及家属授权同意，严格遵守医学伦理道德，并得到相关伦理部门批准。人卵巢颗粒细胞系KGN 由南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科惠赠。DMEM/F12 培养基、FBS 胎牛血清购于Gibco 公司;流式抗体小鼠抗人CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC 以 及HLA-DR-PE 购于eBioscience 公司;CCK-8 试剂购于日本同仁化学所，PI 购于Sigma 公司。

1.2 细胞培养

1.2.1 脐带间充质干细胞(MSCs)的分离培养及表型鉴定 无菌条件下取出脐带，立即放入灭菌预冷PBS 保存。取回后4 h 内按照本实验室方法进行处理。首先，用含1%青链霉素混合液的PBS 洗去脐带表面血块，用眼科镊子将脐动脉和静脉剥除，放入含DMEM/F12 的培养皿中，剪碎至8～10 mm3小块。然后，离心去除培养基，加入预先配置好的含250 U/ml 胶原酶Ⅱ，100 U/ml 中性蛋白酶及10 U/ml 透明质酸酶混合液，放入37℃摇床，振荡消化2～3 h 至组织基本消化完全。经PBS 洗3 遍、DMEM/F12 洗2 遍，去除混合酶液。将细胞及组织碎片倒入培养瓶，加入含10%FBS、1%青霉素-链霉素混合液及DMEM/F12 的完全培养基，放入37℃二氧化碳培养箱培养(5%CO2)，避免移动。3 d 后，除去未贴壁细胞及组织碎片，更换完全培养液，以后每3 d 更换一次，待成纤维样细胞集落密度达80%左右，用0.25%EDTA 胰酶消化传代，取第4～8 代细胞进行免疫表型鉴定。消化收集后，用PBS 洗两遍，调整细胞密度为大约1×106ml-1，每管加入100 μl 细胞悬液，再按照建议浓度分别加入各自的流式抗体进行标记。避光孵育30 min，PBS 洗两遍去除未标记抗体;加入2%多聚甲醛，4℃避光固定30 min;应用BD 公司FACSCalibur 流式细胞仪检测免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45 以及HLA-DR，确认为MSCs 后用于实验。

1.2.2 KGN 细胞培养 与MSCs 用相同的完全培养基在37℃二氧化碳培养箱进行常规培养，保持5%的CO2以维持pH 恒定。

1.3 CCK-8 法检测细胞活力

1.3.1 细胞毒性检测 CCK-8 试剂盒是基于WST-8 还原性的检测试剂，WST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成橙色甲臜染料，培养基颜色与活细胞数量成正比。KGN 细胞以3×103个/孔，接种至96 孔板，置于37℃培养箱过夜预培养，第二天分别加入2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素处理24 h 和48 h，按照CCK-8 说明书加入试剂，孵育1～4 h，测定450 nm 处的吸光值。

1.3.2 细胞活力检测 KGN 分组:(1)Control 组;(2)MSCs 上清组;(3)雷公藤甲素组;(4)MSCs 上清+雷公藤甲素组。用胰酶常规消化KGN 细胞，同样将KGN 细胞以3×103个/孔，接种至96 孔板过夜预培养。向(3)(4)组加入40 nmol/L 雷公藤甲素处理24 h，(1)(2)用等量DMSO 作为对照;再向(2)(4)组加入MSCs 上清，(1)(3)加入完全培养基，24 h 后检测细胞活力。

1.4 流式细胞术检测细胞周期 碘化丙啶PI(Propidium Iodide)是一种核酸荧光染料，能够与DNA 和RNA 分子的碱基对进行插入性结合。将处理后的KGN 加入无EDTA 胰酶消化，用PBS 洗两遍，再加入预冷的70%乙醇固定，置于4℃过夜;离心去除乙醇，再加入PBS 洗两遍，加入含0.1% Triton X-100及2%RNase 的PI 工作液(PI 终浓度为50 μg/ml)悬起细胞，室温避光孵育30 min，上机检测，用ModFit LT 软件分析周期。

1.5 Real-Time PCR 法检测mRNA 表达 利用Trizol 法提取KGN 的总RNA，经氯仿抽提、分相及异丙醇沉淀后，用预冷的DEPC-75% 乙醇洗涤RNA，加入DEPC 水，在56℃条件下金属浴熔解10 min，用紫外分光光度计测定浓度。定量0.5 μg 进行反转录。反应在TaKaRa 公司的PCR 仪中进行，20 μl 的反转录体系为:5× RT buffer 4 μl、dNTP 2 μl、RNase inhibitor 1 μl、Oligo d(T)1 μl、ReverTra Ace 0.5 μl、RNA 0.5 μg，再加入DEPC 水补足20 μl;反应在42℃20 min、99℃5 min 及4℃5 min，得到cDNA。随后利用ABI 公司的StepOnePlus 荧光定量PCR 仪检测mRNA 表达。引物序列为:βactin:Fp 5'-TCTGGCACCACACCTTCTA-3'，Rp 5'-AGGCATACAGGGACAGCAC-3';CDKN1A:Fp 5'-CTCATCCCGTGTTCTCCTTT-3'，Rp 5'-GTACCACCCAGCGGACAAGT-3'。10 μl 反应体系为:SYBR Green Supermix 5 μl、Forward primer 0.5 μl、Reverse primer 0.5 μl、cDNA 2 μl(预先稀释10 倍)以及ddH2O 2 μl，反应条件:95℃10 min;95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s 共40 循环;95℃15 s、60℃30 s、95℃15 s 绘制溶解曲线，用2-ΔΔCT法计算得出CDKN1A 的相对表达量。

1.6 数据统计 实验结果均重复三次，数据用Graphpad Prism 5 软件统计，计量数据以±s 表示。组间单因素采用One-way-ANOVA，双因素采用Twoway-ANOVA，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤甲素抑制KGN 活力 将KGN 以3×103个/孔接种于96 孔板，过夜预培养后，分别用2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素处理KGN 24 及48 h，CCK-8 检测雷公藤甲素对KGN 的细胞毒作用，结果显示，雷公藤甲素处理24 h 后，KGN 活力在40 nmol/L 以上受到抑制(图1A)，光镜下也可以看出这种抑制作用(图2B，40 nmol/L);而处理48 h 后，雷公藤甲素对KGN 活力的抑制呈剂量依赖性(图1A)。

2.2 MSCs 的培养及鉴定 取回的新鲜脐带经处理、培养，得到大量扩增的成纤维样细胞(图2A)。传代后其免疫表型的检测结果如图2B 所示，CD29、CD44、CD90 及CD105 分子的表达呈阳性，CD31、CD34、CD45 及HLA-DR 的表达呈阴性，符合MSCs表面抗原的表达特征，经鉴定后确认为MSCs，其培养上清用于后续的实验。

2.3 MSCs 上清可提高雷公藤甲素处理的KGN 细胞活力 为了获取MSCs 的培养上清，我们先进行了MSC 预铺板(按照MSC∶KGN=1∶5的比例)，过夜后更换完全培养基，24 h 后收集MSCs 上清。用CCK-8 法对KGN 的活力进行检测，发现MSCs 上清对正常KGN 活力没有明显影响，而对雷公藤甲素损伤的KGN 活力有显著提升(图3)。

2.4 MSCs 上清可缓解雷公藤甲素对KGN 的S期阻滞 我们用PI染色法对KGN的周期分布进行了分析，分组同上，每组设置3 复孔。结果如图4 所示，在雷公藤甲素的作用下，我们发现KGN 的细胞周期出现了明显的S 期阻滞(Control 组:Dip G1:76.17%，Dip S:13.10%，Dip G2:10.73%;雷公藤甲素组:Dip G1:45.96 %，Dip S:47.11 %，Dip G2:6.927 %);而用MSCs 上清处理后，雷公藤甲素阻滞的KGN S 期细胞比例有所下降(MSCs 上清+雷公藤甲素组:Dip G1:54.35 %，Dip S:41.99 %，Dip G2:3.665 %)，说明MSCs 培养上清能够减轻雷公藤甲素引起的S 期阻滞程度。此外，单独MSCs上清作用不影响KGN 细胞周期(Dip G1:77.96%，Dip S:13.87%，Dip G2:8.170%)。

图1 雷公藤甲素对KGN 活力的影响Fig.1 Effect of triptolide on cell viability of KGN

图2 MSCs 的形态学观察及免疫表型鉴定Fig.2 Morphological observation and immunophenotype identification of MSCs

图3 MSCs 上清对雷公藤甲素处理的KGN 活力的影响Fig.3 Effect of MSCs conditioned medium on cell vitality of triptolide treated KGN

图4 MSCs 上清对雷公藤甲素处理的KGN 周期的影响Fig.4 Effect of MSCs conditioned medium on cell cycle distribution of triptolide treated KGN

2.5 MSCs 上清减轻雷公藤甲素引起的周期阻滞与CDKN1A 有关 我们采用Real-time PCR 法检测了p21 编码基因CDKN1A 的表达，见图5。结果表明，雷公藤甲素处理使KGN 的CDKN1A 表达呈现显著上调，说明雷公藤甲素诱导的KGN S 期阻滞与CDKN1A 异常上调有关;同时，在雷公藤甲素处理过损伤的KGN 组中，MSCs 上清的作用在一定程度上降低了CDKN1A 的表达，但无显著性差异。这提示，MSCs 上清可能通过调控雷公藤甲素导致的CDKN1A 异常表达而减轻雷公藤甲素引起的KGN S期阻滞。

图5 MSC 上清对雷公藤甲素处理的KGN 表达CDKN1A的影响Fig.5 Influence of MSCs conditioned medium on expression of CDKN1A in triptolide treated KGN

3 讨论

卵巢颗粒细胞参与了卵泡的发生以及激素合成，已有不少研究表明雷公藤具有生殖毒性，且有研究指出这可能与对卵巢颗粒细胞的损伤有关［6］，Chen 等［7］发现雷公藤能够使卵泡颗粒细胞层减少，从而影响卵泡发育。此外，作为雷公藤的主要成分，雷公藤甲素对多种细胞都表现出抗增殖能力［9］，能下调结肠癌细胞的多种细胞因子受体及周期调控因子的表达，抑制VEGF 和COX-2 等分泌，从而调节结肠癌细胞周期进程、抑制其增殖及迁移［15］;Zhao等［16］研究表明雷公藤还能抑制卵巢癌细胞的侵袭，而且对其增殖的抑制具有剂量依赖性。这提示，作为雷公藤的主要成分，雷公藤甲素的毒性可能对卵巢颗粒细胞的生长产生影响。但是对大鼠卵巢颗粒细胞的研究表明，较低浓度的雷公藤甲素可以影响对雌二醇和孕酮的分泌，而对于其细胞活力没有明显影响［17，18］，这提示雷公藤甲素对人和鼠的卵巢颗粒细胞的影响可能存在浓度及种属差别。我们用CCK-8 法检测了雷公藤甲素对KGN 细胞活力的影响，发现雷公藤甲素能够剂量依赖性地抑制KGN 活力(图1A)，影响其细胞数目的增多(图1B)。雷公藤甲素不仅影响细胞活力，还能够造成多种细胞系的周期阻滞，比如对乳腺癌细胞系MDA-231 细胞及胆囊癌细胞系GBC-SD 及SGC-996 的S 期细胞周期阻滞［19，20］，对子宫内膜癌及卵巢癌细胞的S 期阻滞等［21］。我们对KGN 细胞周期进行了分析，发现雷公藤甲素同样能够引起KGN 的S 期阻滞(图4)。

为探讨MSCs 上清对雷公藤甲素损伤的KGN活力是否有影响，我们分离培养了脐带来源MSCs，并对其免疫表型进行了检测。MSCs 一般呈长梭形，表达CD29、CD44、CD90、CD105 分子，不表达造血系分子表型CD34 及CD45，内皮细胞标记物CD31 及人MHCⅡ类分子HLA-DR［22］。我们用混合酶消化结合贴壁法获得的MSCs 形态均一，纯度在90%以上，经流式细胞术检测，其表面分子的表达符合MSCs 的普遍特征(图2)。MSCs 能够产生和分泌血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源生长因子(PDGF)及基质细胞衍生因子(SCF)等多种生长因子，具有营养与支持、免疫调节、抗凋亡抗体、促进血管生成等属性［23］，能支持细胞的生长，促进卵巢损伤等组织修复。此外，MSCs 上清还可保护化疗药物对细胞的杀伤［24］。我们的实验表明，雷公藤甲素损伤的KGN 在MSCs 上清作用下，其活力显著高于损伤的对照(图3)，进一步的细胞周期分析更显示，MSCs 上清能够显著降低其S 期阻滞的阻滞程度(图4)。

CDKN1A 是细胞周期负性调节因子p21 的编码基因，p21 的过度表达提示细胞周期阻滞［25］。我们推测，雷公藤甲素引起的KGN 细胞S 期阻滞可能与CDKN1A 有关。实验结果显示，雷公藤甲素将KGN的CDKN1A 表达上调了约15 倍，此外，MSCs 上清的处理可以降低CDKN1A 的表达，虽没有统计学差异，但这也提示了CDKN1A 可能与MSCs 上清缓解雷公藤甲素引起的KGN S 期阻滞程度有关(图4)。

总之，我们的研究发现雷公藤甲素能够直接抑制KGN 的活力，造成KGN 的S 期阻滞，从而抑制KGN 的生长，表现出对CDKN1A 的异常上调;而MSCs 上清则提高了雷公藤甲素损伤的KGN 的活力，降低了其S 期阻滞程度，同时还轻微降低了其CDKN1A 的表达。提示MSCs 上清可能减轻雷公藤甲素对KGN 细胞的损伤作用，这可能和影响CDKN1A 的表达有关。

［1］Edmonds SE，Montgomery JC.Reversible ovarian failure induced by a Chinese herbal medicine:lei gong teng［J］.BJOG，2003，110(1):77-78.

［2］郝 丽，卢 文，林 辉，等.雌孕激素替代治疗雷公藤所致卵巢早衰的疗效观察［J］.中华肾脏病杂志，2005，21(3):143-145.

［3］史建辉，王敏捷，刘秀典.雷公藤致高促性腺激素闭经2 例［J］.中国新药与临床杂志，2003，22(10):635-636.

［4］Chen H，Li J，Cui T，et al.Adjuvant gonadotropin-releasing hormone analogues for the prevention of chemotherapy induced premature ovarian failure in premenopausal women［J］.Cochrane Database Syst Rev，2011(11):CD008018.

［5］Ginsburg J，Isaacs AJ，Gore MB，et al.Use of clomiphene and luteinizing hormone/follicle stimulating hormone-releasing hormone in investigation of ovulatory failure［J］.Br Med J，1975，3(5976):130-133.

［6］Chen X，Chen SL.A woman with premature ovarian failure induced by Tripterygium wilfordii Hook.f.gives birth to a healthy child［J］.Fertil Steril，2011，96(1):e19-21.

［7］Chen XY，Gu C，Ma M，et al.A mouse model of premature ovarian insufficiency induced by tripterygium glycoside via subcutaneous injection［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(1):144-151.

［8］王桂玲，任春娥，王 丽.雷公藤多甙对雌性大鼠不良反应的实验研究［J］.河北医药，2009，31(4):416-418.

［9］Zhou ZL，Yang YX，Ding J，et al.Triptolide:structural modifications，structure-activity relationships，bioactivities，clinical development and mechanisms ［J］.Nat Prod Rep，2012，29 (4):457-475.

［10］Le Blanc K.Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells［J］.Cytotherapy，2003，5(6):485-489.

［11］Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(9):726-736.

［12］Caplan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators［J］.J Cell Biochem，2006，98(5):1076-1084.

［13］Sun M，Wang S，Li Y，et al.Adipose-derived stem cells improved mouse ovary function after chemotherapy-induced ovary failure［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4(4):80.

［14］李威娜，谢琪璇，秦俊文，等.骨髓间充质干细胞对免疫损伤卵巢的修复作用［J］.南方医科大学学报，2011，31(5):825-829.

［15］Johnson SM，Wang X，Evers BM.Triptolide inhibits proliferation and migration of colon cancer cells by inhibition of cell cycle regulators and cytokine receptors［J］.J Surg Res，2011，168(2):197-205.

［16］Zhao H，Yang Z，Wang X，et al.Triptolide inhibits ovarian cancer cell invasion by repression of matrix metalloproteinase 7 and 19 and upregulation of E-cadherin ［J］.Exp Mol Med，2012，44(11):633-641.

［17］Zhang J，Jiang Z，Mu X，et al.Effect of triptolide on progesterone production from cultured rat granulosa cells［J］.Arzneim Forsch Drug Res，2012，62(6):301-306.

［18］Zhang J，Liu L，Mu XM，et al.Effect of triptolide on estradiol release from cultured rat granulosa cells［J］.Endocr J，2012，59(6):473-481.

［19］Hu YP，Tan ZJ，Wu XS，et al.Triptolide induces s phase arrest and apoptosis in gallbladder cancer cells［J］.Molecules，2014，19(2):2612-2628.

［20］Liu J，Jiang Z，Xiao J，et al.Effects of triptolide from Tripterygium wilfordii on ERalpha and p53 expression in two human breast cancer cell lines ［J］.Phytomedicine，2009，16 (11):1006-1013.

［21］Li H，Takai N，Yuge A，et al.Novel target genes responsive to the anti-growth activity of triptolide in endometrial and ovarian cancer cells［J］.Cancer Lett，2010，297(2):198-206.

［22］Calloni R，Cordero EA，Henriques JA，et al.Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells［J］.Stem Cells Dev，2013，22(9):1455-1476.

［23］Doorn J，Moll G，Le Blanc K，et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells:paracrine effects and potential improvements［J］.Tissue Eng，2012，18(2):101-115.

［24］Konopleva M，Konoplev S，Hu W，et al.Stromal cells prevent apoptosis of AML cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins［J］.Leukemia，2002，16(9):1713-1724.

［25］Zhang Y，Hu K，Hu Y，et al.Bone marrow mesenchymal stromal cells affect the cell cycle arrest effect of genotoxic agents on acute lymphocytic leukemia cells via p21 down-regulation［J］.Ann Hematol，2014，93(9):1499-1508.