肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IL-10 影响上皮性卵巢癌肿瘤微环境中T 细胞亚群Treg/Th17 失衡①

吴小丽 张 婷 王昕婧 王 凯 汪希鹏 (同济大学附属第一妇婴保健院妇科，上海 200040)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，Eoc)是目前妇产科肿瘤中致死率最高的疾病。多数患者在发现时已经处于临床晚期，表现为腹腔广泛转移［1］。这一临床特征提示患者预后不良，5 年生存率仅为30%左右［2］。研究发现，腹膜是Eoc 转移的最常见部位［3］。我们课题组前期研究证实:Eoc 腹膜种植灶浸润的免疫细胞中数量最丰富的是巨噬细胞(70%)，其次为CD4+T 细胞(25%)［4］，CD4+T 细胞可以分化为两种T 细胞亚群，一种是分泌IL-17的Th17 细胞［5］，另一种是CD4+CD25+调节性T 细胞［6］(regulatory T cells，Treg cells)。Th17 与Treg 比例平衡与肿瘤进展关系密切。有研究显示，胃癌肿瘤微环境中，Treg/Th17 的比值增加，与胃癌进展有关［7］。课题组前期研究已经发现，卵巢癌患者外周血及卵巢癌微环境中Treg/Th17 细胞比例同样表现上升趋势(文章待发表)，由于卵巢癌腹膜微环境中的免疫细胞主要以巨噬细胞为主，因此本课题旨在探讨Treg 细胞与Th17 细胞是否受巨噬细胞调控，阐述卵巢癌微环境缺陷机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 RPMI1640 培养液、胎牛血清、青-链霉素、PBS、胰蛋白酶购自Gibco 生物技术公司;Triton X-100 购自aMResco 公司;抗人CD14 及CD4磁珠，配套分选柱及分选装置购自德国美天旎公司，CD3、CD28 抗体购自BD Bioscience 公司，PE 标记的鼠抗人IL-17 抗体、Percp-cy5.5 标记的鼠CD4 抗体、APC 标记的Foxp3 抗体，相关同型对照抗体以及破膜剂均购自eBioscience 公司;结晶紫、甲醇、脱氧胆酸钠，均购自国药集团化学试剂公司;ELISA 试剂盒购自R＆D 公司;DAPI 核荧光染料购自Sigma公司;Transwell 专用24 孔板购自Conning 公司;Western 特异性抗体购自Abcam 公司;内参及相关裂解液购自CST 公司;Skov-3 细胞系，购自中科院细胞库。其余耗材由上海市第一妇婴保健院中心实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 CD14+单核细胞及CD4+T 细胞的分离和培养 外周血单个核细胞由上海市血液中心提供，外周血PBMC 中的CD14+单核细胞以及CD4+T 细胞采用MACS 磁珠分选计数进行纯化，具体步骤如下:将分选柱置于Mini MACS 分选器上，将密度梯度离心后得到的外周血单个核细胞用PBS 缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD14 微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8℃孵育15 min，PBS 缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min 离心10 min，完全去除上清，用500 μl PBS 缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS 分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl 缓冲液冲洗MS 柱，此为CD14阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml 缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞即是磁性标记的CD14 阳性单核细胞。将CD14 阴性的细胞继续用CD4 微珠标记后重复上述步骤，分选得到CD4 阳性的T 细胞。将磁珠分选得到的细胞重悬于RPMI1640 全培养基中，置于37℃，5%CO2的温箱中培养。分离得到的CD4+T 细胞或CD14+单核细胞纯度都在90%以上。

1.2.2 巨噬细胞诱导分化及T 细胞的活化 磁珠分选得到的CD14+单核细胞以每孔106个铺于6 孔板中，分别加入M-CSF(25 ng/ml)，M-CSF(25 ng/ml)+LPS(100 ng/ml)+IFN-γ(20 ng/ml)，M-CSF(25 ng/ml)+IL-4(20 ng/ml)于RPMI1640 全培养基中，培养3 d，诱导为M0、M1、M2 型巨噬细胞［8］。磁珠分选得到的CD4+T 细胞，培养于预先包被有CD3(10 μg/ml)抗体的6 cm 培养皿中，同时加入CD28抗体(10 μg/ml)。培养3 d。

1.2.3 巨噬细胞与T 细胞共培养 将活化后的T细胞在6 孔板中以5×105个/每孔与巨噬细胞(M0、M1、M2 三组)共培养，以1640 全培养基，37℃，5%CO2培养3 d 后进行下一步实验。

1.2.4 流式检测共培养后T 细胞中Th17、Treg 占CD4+T 细胞比例 共培养后的CD4+T 细胞用Percpcy5.5-CD4 抗体，PE-IL-17 抗体及APC-Foxp3 抗体标记，用流式检测Th17 细胞及Treg 细胞占CD4+T 细胞的比例。方法如下:取约1×106细胞重悬于100 μl 缓冲液中，加入FcR 抗体封闭10 min 后加入5 μl 的CD4 抗体，充分混匀，于4℃避光孵育30 min，用PBS洗2 遍后加入破膜剂，4℃避光孵育45 min，PBS 洗2遍后加入IL-17 及Foxp3 抗体，4℃避光孵育30 min，PBS 洗2 遍，500 μl 重悬，上机检测。结果用阳性细胞占CD4+T 细胞百分比表示。由于IL-17 是分泌型蛋白，所以CD4+T 细胞在流式检测前预先加入佛波酯(PMA)，离子霉素和莫能霉素的混合物(eBioscience)刺激4～6 h 后进行抗体染色。

1.2.5 Western blot 检测共培养后T 细胞内转录因子的表达 蛋白质抽提:将共培养后的T 细胞离心弃上清，在离心管中加入适量预冷的含抑制剂PMSF 的RIPA 蛋白质裂解液，经变性，电泳，转膜后，5% 脱脂牛奶封闭，加入一抗过夜，一抗分别是小鼠抗人Gabdh 抗体(1∶5 000)，小鼠抗人Foxp3 抗体(1∶200)，小鼠抗人RORrt 抗体(1∶5 000)。TBST漂洗3 次后用相应的羊抗小鼠二抗 室温孵育1 h后，漂洗，用ECL 发光液(millipore)显色，拍摄。

1.2.6 肿瘤细胞增殖实验 人卵巢癌细胞系Skov-3 细胞以5 000 个细胞每孔铺于96 孔板，将共培养后的上清和RPMI1640 全培养基1∶1混合后加入，200 μl 每孔。培养1 d、2 d 后用结晶紫法检测肿瘤细胞增殖情况，6 个复孔，重复3～5 次，铺板同时以5 000～20 000 个Skov-3 细胞/孔的浓度梯度铺板，贴壁后以结晶紫法检测，获得浓度梯度曲线，方程为:y=39 773x-2 814，R2=0.991(其中x 为测得荧光值)将后两天测得各孔荧光值代入方程计算，得出细胞数。

1.2.7 肿瘤细胞迁移实验 人卵巢癌细胞系Skov-3 以每孔1.5×105个铺于专用24 孔transwell 板中，上室加入200 μl 含有1%血清的RPMI1640 培养基，下室加入800 μl 的共培养后的条件培养基。20 h 后下室中的细胞用荧光染料染色，用荧光显微镜观察细胞穿透的情况，每个孔取6 个视野计数。

1.2.8 ELISA 检测上清中IL-10 的含量 收集M0、M1 及M2 巨噬细胞与CD4+T 细胞共培养体系中的共培养上清，用于检测上清中IL-10 的浓度，具体操作步骤完全按照R＆D 公司生产的IL-10 ELISA 试剂盒说明书。简要步骤如下:上清100 μl 加入预包被的96 孔板中，室温摇床孵育2 h，Wash Buffer 清洗4 次后加入IL-10 结合抗体，室温摇床孵育2 h，Wash Buffer 清洗4 次，加入显色剂，孵育30 min，室温避光，加入中止液，酶标仪450nm 检测读数。

1.3 统计学方法 数据处理用SPSS 软件13.0，计量资料以±s 表示，Treg/Th17 比值变化用t 检验，Western 数据用非参数检验，细胞增殖用ONEWAY ANOVA，迁移用Kruskal Wallis 检验，IL-10 含量用ONEWAY ANOVA。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 M2 型巨噬细胞通过影响T 细胞转录因子，诱导Treg/Th17 比值上调 CD4+T 细胞与M0、M1、M2型巨噬细胞共培养3 d 后用流式检测共培养后的CD4+T 淋巴细胞中Th17 (CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)比例，发现与M2 型巨噬细胞共培养后的CD4+T 细胞中Treg/Th17 比值为0.76±0.33 相比Control 组0.41±0.25，M0 组0.40±0.32 与M1 组0.31±0.16 有显著增高(P＜0.05)，而Control 组、M0组、M1 组之间没有统计学差异(图1A、B)。

图1 M2 型巨噬细胞诱导Treg/Th17 比例上升Fig.1 M2 macrophage induce increase of ratio of Treg/Th17

Foxp3 是Treg 细胞的特异性转录因子，而RORrt 是Th17 细胞的特异性转录因子。收集与巨噬细胞共培养后的CD4+T 细胞，分析T 细胞中的这两种转录因子含量的变化，发现与M2型巨噬细胞共培养后的T 细胞中Foxp3 蛋白的含量相对于M1组增加(P=0.047)，而RORrt 的含量出现下降趋势但没有统计学差异(P=0.294)(图2)。

图2 M2 型巨噬细胞诱导Foxp3 增多Fig.2 M2 macrophage induced increase of Foxp3 expression

2.2 巨噬细胞诱导T 细胞格局变化，促进肿瘤细胞的增殖和迁移 将巨噬细胞与T 细胞共培养的上清加入Skov-3 的培养基中，共培养1 d 后，全培养基组(Control 组)数量为12 445.57±179.34，CD3/28组为 12 470.32 ± 434.18，M2 组 明 显 上 升为14 942.43±434.19，差异有统计学差异(P＜0.001);共培养2 d 后，Control 组细胞数增长为25 622.81±897.07，CD3/28 组为25 721.62±1 808.60，M2 组显著提高为30 129.09±520.53，差异有统计学差异(P＜0.05)(图3C)。同时，在比较了上清对肿瘤细胞迁移能力的影响后发现了同样的结果，Control 组迁移的肿瘤细胞数为(92.25±17.16)个，CD3/28组为(157.87±18.41)个，M2 组为(534±62.66)个，差异有显著统计学意义(P＜0.001)(图3A、B)。

2.3 肿瘤相关巨噬细胞分泌IL-10 增多促进Treg分化 用ELISA 法检测共培养后上清中IL-10 的含量发现，在M2 与CD4+T 细胞共培养的上清中，IL-10 的含量为(264.04±75.9)pg/ml，较CD3/28 组(60.89±46.54)pg/ml，M0 组(44.81±32.93)pg/ml，M1 组(42.71 ±26.09)pg/ml 均 显 著 提 高(P=0.001)。见图4。

图3 不同共培养上清对Skov-3 增殖和迁移的影响Fig.3 Effect of different co-culture supernatant on proliferation and migration of Skov-3 cells

图4 共培养上清中IL-10 含量的差异Fig.4 Level of IL-10 in supernatant of four groups

3 讨论

幼稚的CD4+T 细胞可以分化为四种类型的T细 胞:Th1、Th2、Th17 和 Treg (regulatory T cells)［9，10］。Th17 细胞主要以分泌IL-17 为特征，同时还可以分泌IL-21、IL-22 和IL-26，在自身性免疫及过敏反应中起到很大的作用［11，12］。而Treg 细胞是一种免疫负调控细胞，多项研究显示Treg 细胞不仅在免疫耐受中扮演着重要的角色，在肿瘤的免疫逃逸中也有一定作用。鉴于这两种细胞在多种恶性肿瘤中都有发现，并且都存在增高的现象〔12-14〕。因此单独分析一种细胞并不能够真实反映疾病的进展情况，所以采用两者比例平衡来研究肿瘤微环境中的免疫格局。

一些研究证实，在多种肿瘤中都有关于Treg/Th17 失衡的现象。在HER2+乳腺癌患者的研究中，外周血Treg/Th17 比例显著高于HER2-患者和健康人［15］。在肺鳞状细胞癌和腺癌的研究中也有类似发现［16］。而课题组的前期研究也发现在卵巢癌患者的肿瘤组织及腹膜中Treg/Th17 的比例同样存在失衡，较良性肿瘤及正常对照组都有增高的现象(文章投稿中)。有关上皮性卵巢癌中这一比例失衡的机制，目前未见报道。课题组猜测卵巢恶性肿瘤组织及腹膜中Treg/Th17 比例失衡是否是由卵巢癌微环境中占免疫细胞70%的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)所调控。我们体外的共培养实验结果证实了这一猜想。因为M2 型巨噬细胞与TAM 细胞极为相似，我们将外周血单核细胞诱导为M2 型巨噬细胞与CD4+T 细胞共培养，共培养3 d 后，CD4+T细胞中的Treg/Th17 平衡发生变化，较对照组、M0及M1 组都有显著增高。同时T 细胞中的特异性转录因子也发生了相应的变化，Treg 的转录因子Foxp3 出现显著上调。

这一结果说明TAM 细胞在肿瘤微环境中已经不仅仅作为抗原提呈细胞发挥作用，同时还能影响微环境中CD4+T 细胞的比例构成。目前在肿瘤微环境的研究中未见类似报道，但是在血吸虫的研究中发现了巨噬细胞对炎症环境中Treg/Th17 平衡的影响，通过调控Treg 细胞比例增大，来抑制急性炎症对肠道组织的损伤［17］。

多项研究表明，TAM 细胞能通过分泌VEGF 等因子促进肿瘤血管生成［18］，从而为肿瘤组织提供充足的营养。那么TAM 对Treg/Th17 平衡的调节对肿瘤细胞而言是否具有某些意义，为了证实这一想法，课题组对M2 型巨噬细胞和T 细胞共培养上清进行研究，发现TAM 细胞与T 细胞共培养后的上清具有显著增强肿瘤细胞增殖和迁移的能力。这与其促进肿瘤血管的生物学行为相统一，通过调节T 细胞格局与血管生成共同促进肿瘤的生长和转移。

M2 型巨噬细胞以高表达CD163、CD206 及IL-10 区别于其他类型的巨噬细胞［19］。而IL-10 作为一种炎症负调控因子，在Treg 及Th17 的分化中扮演着重要的角色。在Glock 等［20］的研究中发现，IL-10 能够激活Treg 细胞中的STAT3 通路，高表达IL-10R，同时抑制Th17 的功能。存在IL-10R 突变的个体将大大增加其患有难治性克罗恩病的风险。缺乏Foxp3、IL-10R 及STAT3 中任意一个基因的小鼠都会出现难以抑制的Th17 介导的结肠炎［21］。最近也有研究证明，抑制小鼠IL-10 受体，可以增强疫苗介导的CD8+T 细胞的抗肿瘤能力［22］。在我们的研究中发现，M2 型巨噬细胞与T 细胞的共培养上清中的IL-10 含量远远高于对照组，我们猜测上皮性卵巢癌微环境中的TAM 细胞可能通过分泌大量的IL-10，激活Treg 细胞中的STAT3 通路，同时抑制Th17，最终导致了Treg/Th17 比例失衡，同时又通过抑制CD8+T 细胞的抗肿瘤能力，从多方面促进肿瘤的增殖和迁移。因此，研究针对TAM 细胞的靶向治疗药物，能够有效地改变肿瘤的免疫微环境，促进机体的抗肿瘤免疫，从而为上皮性卵巢癌的治疗开辟新的路径。

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