马齿苋提取物对急性湿疹大鼠皮肤TNF-α与IL-4 表达的影响①

葛一漫 张朝明 胡一梅 王 毅 吴心语 谢国丽 张灵玲

(成都中医药大学临床医学院，成都 610072)

急性湿疹，又称特应性皮炎，是一种复发性、炎症性皮肤疾病，主要表现为广泛的、多形性对称性红斑丘疹、皮肤瘙痒、干燥、炎症等，影响着全世界15%～30%的儿童和2%～10%的成年人［1］。湿疹是由多种内、外因素引起的皮肤病，发病机制复杂，一般认为与变态反应有较密切的关系。治疗湿疹这类变态反应包括了局部类固醇和免疫调节剂的应用。此类药物如糖皮质激素虽有较好的免疫抑制作用，但会出现皮肤萎缩、色素沉着等不良反应，还可能出现代谢紊乱、诱发加重感染，不宜长期使用［2，3］。马齿苋含有大量的多糖、挥发油、氨基酸等有效成份，具有止痒收涩功能，对湿疹的疗效显著［4］。

本实验拟通过运用马齿苋提取物对急性湿疹大鼠模型的进行干预治疗，观察大鼠皮肤的肿胀度，结合局部皮损处TNF-α、IL-4 的表达，从促炎因子和抗炎因子平衡的角度，探讨马齿苋提取液对湿疹的抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠，SPF 级，雌雄不限，体重180～220 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物合格证号:SCXK(111)2008-24。

1.2 药物与试剂

1.2.1 马齿苋提取液 500 g 新鲜马齿苋放于榨汁机内榨取新鲜马齿苋粗汁200 ml，用无菌纱布5 层过滤，获得浅红色马齿苋提取液，盛放于消毒处理的玻璃瓶内，置于低温0～5℃保存备用。

1.2.2 阳性药 复方黄柏液，山东汉方制药有限公司，生产批号:Z10950097。

1.2.3 2，4-二硝基氯苯(DNCB) 成都科龙化工试剂厂，批号:20090813。

1.3 实验分组及造模 SD 大鼠40 只，随机分为4个组，每组10 只，分别作为正常组、模型组、复方黄柏组、马齿苋组。用电推剪及电剃须刀去除大鼠腹部毛发，面积约2 cm×3 cm，并涂5%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)30 μl 于皮肤首次致敏，第3 天，在右背部剃毛区涂0.2%DNCB 50 μl 进行二次抗原攻击，左背部对称的剃毛区不用药物作为对照部位。以后每隔3 d 激发1 次，连续3 次。于第9 天观察大鼠右背部较左背部明显出现红斑、水肿、丘疹、糜烂或渗出，表明造模成功。于第10 天开始，模型组、复方黄柏组、马齿苋组分别给予1 ml 无菌蒸馏水、复方黄柏液和马齿苋提取液，每天2 次，上下午各1次，连续9 d。所有实验均根据赫尔辛基宣言和保护及运用动物的指导原则进行。

1.4 实验取材 造模后第21 天，断颈处死动物，使用无菌手术剪将大鼠后背部右侧造模区皮肤两块及对称的左侧健康皮肤一块分别剪下，第一块造模区皮肤与左侧健康皮肤均采用直径6 mm 圆形打孔器分别打下相同面积的皮肤，用分析天平(BS-600L，规格:600 g/0.1 g，上海友声衡器有限公司)称重(计量单位mg，精确到0.1 mg)。第二块造模区皮肤，装于DEPC 水处理过的EP 管中，放置10%中性甲醛溶液中固定48 h，待做免疫组化检查。

1.5 观察指标

1.5.1 皮肤肿胀度指标 皮肤肿胀度=炎症皮肤重量-健康皮肤重量，抑制率%=(炎症皮肤重量-健康皮肤重量)/健康皮肤重量×100%。

1.5.2 免疫组化检测TNF-α、IL-4 含量 取上述经过固定的皮肤组织，取材、逐级酒精脱水、浸蜡，石蜡包埋，切片2 张，厚度4 μm，采用免疫组化SP 法分别做TNF-α、IL-4 染色，操作按照说明书进行，设置阳性及阴性对照。TNF-α 一抗(克隆号:BA0131，兔抗鼠TNF-α 多克隆抗体)，IL-4 一抗(克隆号:BA0980，兔抗鼠IL-4 多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司，相应二抗及试剂盒购自北京中杉生物有限公司)。阳性物质判定标准:阳性物质呈棕黄色、黄色、浅黄色，颗粒状、细丝状，位于细胞浆内或间质内。显微镜下观察TNF-α、IL-4 免疫组化染色切片，首先在低倍(×100)下观察阳性物质分布、范围及位置，选择阳性物质最明显处(“热点”)5 个视野，然后在中倍(×200)下，采用Image-Pro Plus 图像分析系统(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量检测上述5 个视野阳性物质的积分光密度(IOD)，计算5 个视野阳性物质的积分光密度总和，表示TNF-α、IL-4 含量。

1.6 统计学方法 用SPSS17.0 软件进行统计分析。检测数据用均±s 表示。采用t 检验，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠皮肤肉眼观察结果 模型组大鼠在二次抗原攻击后的9 d 内，右背部较左背部皮肤出现明显红斑、水肿、丘疹、糜烂和渗出(图1A)。复方黄柏组、马齿苋组随着给药时间的持续，大鼠右背部皮肤红斑、水肿、丘疹、糜烂和渗出症状得到明显的改善(图1B、C)。马齿苋组比复方黄柏组症状改善更为明显(图1C)。

2.2 各组大鼠皮肤肿胀度以及抑制率结果 大鼠皮肤肿胀度及抑制率值，用药组与模型组相比有极显著性差异(P＜0.01)，马齿苋组与复方黄柏组相比也具有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠皮肤组织TNF-α、IL-4 观察检测结果 显微镜下观察TNF-α、IL-4 免疫组化染色切片(见图2、3)，可见TNF-α、IL-4 阳性物质呈颗粒状、细丝状，棕黄色、黄色、浅黄色，位于皮肤表皮棘细胞、皮肤附属器汗腺细胞、皮脂腺细胞、毛囊细胞、真皮内炎细胞胞浆，部分位于真皮内间质组织中。

空白组大鼠背部皮肤内TNF-α、IL-4 阳性物质染色浅黄色，分布面积小、稀疏(A1、A2)。模型组大鼠背部皮肤组织内TNF-α、IL-4 阳性物质染色呈棕黄色、黄色，分布面积广、密集(B1、B2)，复方黄柏组和马齿苋组TNF-α、IL-4 阳性物质染色呈黄色、浅黄色，分布面积缩小、较稀疏(C3、C4、D3、D4)。各组大鼠背部皮肤TNF-α、IL-4 半定量检测结果，与模型组相比，复方黄柏组和马齿苋组对湿疹大鼠皮肤组织有明显的抑制作用(P＜0.01)。与复方黄柏组比较，马齿苋组TNF-α、IL-4 含量也明显降低也(P＜0.05)。见表2。

表1 马齿苋提取液对急性湿疹大鼠皮肤肿胀度的影响( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

表1 马齿苋提取液对急性湿疹大鼠皮肤肿胀度的影响( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，2)P＜0.01.

图1 大鼠皮肤肉眼观察结果Fig.1 Results of macroscopic observation of rat skin

图2 皮肤组织中TNF-α 的表达(免疫组化染色，×200)Fig.2 Expression of TNF-α in skin tissue(immunohistochemical staining，×200)

图3 皮肤组织中IL-4 的表达(免疫组化染色，×200)Fig.3 Expression of IL-4 in skin tissue (immunohistochemical staining，×200)

表2 马齿苋提取物对急性湿疹大鼠皮肤TNF-α、IL-4 的影响( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

表2 马齿苋提取物对急性湿疹大鼠皮肤TNF-α、IL-4 的影响( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with normal control group，1)P＜0.01;compared with model group，2)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，3)P＜0.05.

3 讨论

急性湿疹是一种由多种内外因素共同作用引起的复发性、炎症性皮肤疾病，主要临床表现为皮肤糜烂渗出、红斑丘疹、水肿、瘙痒等。马齿苋属马齿苋科，是我国古老的菜药兼用植物，据《本草纲目》记载，临床可用于“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋，治产后虚汗”［5］。现代科学研究表明［6，7］，马齿苋含有大量多糖、氨基酸、去甲肾上腺素等活性成分，具有消炎抑菌、增强免疫等作用。临床上使用复方黄柏液治疗婴儿急性湿疹起到了较好作用，因此选择该药作为本实验的阳性药物［8］。本实验发现，模型组大鼠右背部皮肤较左背部明显出现红斑、水肿、丘疹、糜烂和渗出，肿胀度明显增加，肿胀抑制率高达41.5%，这与Kim 等［9］报道的急性湿疹症状一致，表明本实验造模成功。用药后，复方黄柏组和马齿苋组大鼠右背部皮肤急性湿疹症状得到明显的改善，其中肿胀度与模型组比较明显减轻，且马齿苋组减轻更为显著，这与胡一梅等［4］报道的鲜马齿苋治疗急性湿疹有明显的疗效是一致的，提示复方黄柏液和马齿苋提取液均能改善湿疹症状，尤以马齿苋提取液效果更为显著。

急性湿疹属于Ⅳ型超敏反应性炎症性疾病，是效应T 细胞与特异性抗原结合后引起的炎症反应。炎症反应过程中炎细胞会释放炎症介质，包括促炎因子与抗炎因子。湿疹发生发展过程中，贯穿着这些炎症介质的相互作用，其变化对湿疹的发展方向与结局产生深远的影响。既往对湿疹机制的研究发现［10，11］，免疫调节异常是湿疹发病的关键环节，尤其是Th 细胞亚群功能失衡，对于促炎因子和抗炎因子及其平衡与湿疹的关系少有报道。鉴于此，本实验通过观察大鼠湿疹皮肤促炎因子肿瘤坏死因子(TNF-α)和抗炎因子白细胞介素(IL-4)的改变，探讨湿疹发生发展与促炎因子和抗炎因子的关系，为临床治疗湿疹提供另一种思路。

TNF-α 属于促炎因子之一，TNF-α 含量增高不仅可促进炎症部位血管扩张、血管壁通透性增加、趋化白细胞、发热、致痛及引起炎症部位组织损伤，导致炎症程度加重，同时，还可引起IL-1、IFN 等促炎因子含量增加，进一步加重湿疹皮损的炎症反应［12］。临床上抗炎作用的途径之一就是通过减少促炎因子包括TNF-α 的产生［13］。本实验结果发现，造模成功后大鼠背部皮肤TNF-α 含量比空白组明显增高，用药后，复方黄柏组和马齿苋组TNF-α 含量明显低于模型组，同时马齿苋组低于复方黄柏组。揭示马齿苋提取液治疗湿疹的可能机制之一是通过下调促炎因子TNF-α 的含量来发挥作用。

IL-4 属于抗炎因子之一，炎症过程中抗炎因子与促炎因子在不同的环节上相互作用、相互拮抗，发挥抑制炎症的作用。研究发现［14］，IL-4 不仅可调节T、B 淋巴细胞的分化、活化，促进以Th2 细胞为特征的免疫应答，同时还可通过抑制单核巨噬细胞产生TNF-α 发挥抗炎作用。本实验结果发现，模型组、复方黄柏组及马齿苋组IL-4 含量显著增高，并随着TNF-α 含量的增高呈比例的增高，表明机体在炎症时炎细胞生成释放一定量促炎因子的同时也生成释放相应量的抗炎因子，限制炎症的加重、放大，发挥炎症的局部防御作用。然而，IL-4 具有抗炎作用的同时也具有促炎作用，它是B 细胞产生IgE 所必需，在湿疹等变态反应中IL-4 分泌过量导致IgE 的增高，IgE 的增高与湿疹发病显著相关［15，16］，所以IL-4具有抗炎/促炎的双重作用。这就意味着在临床控制炎症时，既要通过调控机体一定程度升高IL-4 的含量发挥其抗炎作用，又要适度控制升高幅度抑制其促炎作用。本实验结果发现，与正常组比，模型组IL-4 显著升高，并与TNF-α 呈比例增高，湿疹症状非常明显，复方黄柏组、马齿苋组大鼠皮肤组织的IL-4 含量轻微升高，但差异无显著性。同时与模型组比，复方黄柏组、马齿苋组大鼠皮肤组织的IL-4含量明显降低，并与TNF-α 呈比例降低，湿疹症状显著减轻，显示模型组湿疹的形成不仅是由于TNFα 显著增高所致，还可能是IL-4 呈比例过度增高引起，复方黄柏和马齿苋提取液治疗湿疹有明显疗效，其机制可能不仅是降低TNF-α 含量，同时还呈比例的降低IL-4 的含量，即马齿苋提取液疗效的另一个机制可能是适度地调控IL-4 的含量。

综上所述，马齿苋提取液对湿疹具有明显的疗效，其机制可能是通过下调TNF-α 的含量，同时适度地调控IL-4 的含量。

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