调控抗病毒干扰素产生的信号转导机制研究进展①

张 辉 崔焕忠 杨 欢 秦贵信 常晓博 尹 健 高云航

(吉林农业大学动物科技学院，长春 130118)

干扰素(Interferon，IFN)是有效抵抗病毒入侵的多功能细胞因子，在先天性免疫抗病毒感染过程中发挥重要作用，探讨病毒抑制干扰素产生的信号转导机制是目前研究的热点［1］。IFN 分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型与Ⅱ型IFN 都具有抗病毒作用，但Ⅰ型IFN 是机体对抗病毒感染的关键因素［2］。I 型IFN 可由多种细胞产生，II 型IFN 只能由NK 细胞、激活T 淋巴细胞、巨噬细胞和神经元细胞等特定细胞产生。Ⅰ型IFN 既然为抗病毒先天性免疫的主要细胞因子，那么它是如何产生，并作用于邻近细胞，防止病毒扩散的呢?首先在内体内，TLR3、TLR7/8和TLR9 分别识别dsRNA、ssRNA 和CpG DNA，导致受体二聚化以及TRIF 和MyD88 的招募反应，起始信号级联放大，激活IRF3/IRF7、NF-κB 和AP-1 通路。RIG-I/MDA5 识别病毒RNA，通过RIG-I 的CARD 结构域激活IFN-β 启动刺激因子(IPS-1)，IPS-1 调节不同的调节子和激酶，诱导IRF3、IRF7 和NF-κB 通路激活。IRF3/IRF7、NF-κB 和AP-1 等转录因子一旦激活，将转运入核，同cAMP 反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白(CBP)一起诱导IFN-α和IFN-β 转录，调控IFN-α 和IFN-β 的产生。IFN-α和IFN-β 一旦产生并分泌到细胞外，通过自分泌和旁分泌的方式直接与IFN 受体结合，联合JAK1 激酶的受体磷酸化，通过SH2 区的磷酸化作用激活STAT1 和STAT2 招募，磷酸化的STAT1 和STAT2与IFN 受体分离后，与IRF9 形成ISGF3 复合物，转运到核后与ISRE 结合，导致上百种ISGs 转录，其中MxA、OAS-1/RNaseL、RIG-I/MDA5、ISG15 和PKR为5 种主要的ISGs［3］。许多ISGs 作为PRRs 识别病毒分子，放大信号通路，增加IFN 产生。本文对激活TLRs、RIG-I/MDA5、JAK-STAT 及ISGs 的信号转导机制研究进展进行综述。

1 Toll 样受体及信号通路

Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)是一类蛋白质家族，能特异地识别病原相关的分子模式(PAMPs)。TLRs 独特的关键信号区域是位于每种TLR 胞内区以及配体上的Toll 样白介素-1 受体(TIR)区域。一旦识别TLRs，PAMPs 通过不同接头蛋白的TIR 区域招募不同激酶，触发不同信号转导，导致特定基因表达，参与清除入侵的病毒［4］，其中TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 与控制病毒感染密切相关［5］。

1.1 TLR3 TLR3 识别poly(I:C)和dsRNA，通过TIR 区与含有TIR 的接头蛋白结合，间接激活IRF3、NF-κB 和AP-1 等转录因子。关于IRF3 的激活，TRIF 的N 末端区域通过NF-κB 活化激酶κ(NAK)-相关蛋白1(NAP1)和肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子3(TRAF3)结合TANK-结合激酶1(TBK-1)/IκB 激酶-ε(IKK-ε)，使IRF3 磷酸化，从而形成二聚体，转运到细胞核表达IFN-β［6］。至于NF-κB 的活化，TRIF 结合TRAF6 和受体相互作用蛋白1(RIP1)，TRAF6 是泛素连接酶，RIP1 通过TRAF6 的泛素化作用被转化生长因子β 活化激酶(TAK)结合蛋白2(TAB2)和TAB3 识别，导致TAK1 激活，随后IKKα 和IKKβ 磷酸化，这两个活化的激酶使IκBα 磷酸化，IκBα 由于泛素化作用降解，释放NFκB 到细胞核。TAK-1 也可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase)、p38 和细胞外信号调节激酶，导致AP-1 家族成员的磷酸化与活化。IRF3、NF-κB 和AP-1 等因子的激活，触发IFN-β 基因转录，诱导IFN-β 产生［7］。

1.2 TLR7/8/9 TLR7/8 识 别19～21 bp 的dsRNA，TLR9 识别DNA 病毒基因组的非甲基化CpG DNA［8］。TLR7/8/9 这三种TLRs都锚定在内体膜上，TLR3 以TRIF 为主要接头蛋白，而TLR7/8/9 以MyD88 为接头蛋白，诱导I 型IFN表达。TLR7/8 通过MyD88 结合TRAF6 和IL-1受体相关激酶1(IL-1 reporter associated kinase 1，IRAK-1)，起始信号转导，导致IRF-5 和IRF-7 激活。TLR9 在含有TRAF6 和IRAK-1，或者IRAK-4 激酶复合物的辅助下，促使MyD88 与IRF7 反应。在不同细胞内，不同IRAK 家族成员发挥不同的功能，在pDCs 中IRAK-1 发挥作用，在HEK细胞中则IRAK-4 起主要作用。IRF7 也可通过与MyD88 或TRAF6 作用而活化，IRF7/IRAK-1 复合物诱导IRAK-1 介导的IRF7 磷酸化，随后磷酸化的IRF7 发生二聚化，转运入核，诱导IFN-α 表达。在此过程中，参与NF-κB 活化的IKKα 起着重要作用［9］，因此IRAK4-IRAK1-IKKα 激酶级联反应可导致IRF7 激活。在pDCs 内TLR7/8 和TLR9 通过MyD88 启动信号转导，激活IRF7 产生IFN-α，在病毒感染过程中发挥重要作用。

2 RIG-I/MDA5 通路

2.1 RIG-I 和MDA5 识别RNA 的特征 维甲酸诱导基因(RIG-I)和MDA5 都是细胞浆基质中识别dsRNA 的受体，二者结构相似，功能不同。MDA5 识别小核糖核酸病毒和poly(I:C)，RIG-I 则识别仙台病毒和流感病毒等负链RNA 病毒，poly(I:C)常用于RIG-I/MDA5 通路的激活［11］。RIG-I 在体外识别RNA 转录产物，5'端具有三磷酸基团的ssRNA 和dsRNA 都能通过RIG-I 激活I 型IFN 产生［12］，那么宿主的细胞浆基质中的受体是如何区分病毒RNAs和自身RNAs，答案不难但却非常复杂。RIG-I 不能识别5'端含有单磷酸的细胞rRNA和tRNA;其次，由于mRNA 和核内小RNA(snRNA)5'端具有甲基鸟苷帽子结构，可保护RNAs 不被其识别和降解。此外，细胞RNAs 即使含有5'三磷酸盐，经常被尿苷、2-硫代尿苷或者2'-O-甲基化转录后修饰，这些修饰能抑制RNA 免疫刺激活性［13］。细胞RNA 在细胞环境下一般不以“裸”分子的形式存在，而是与众多的RNA 结合蛋白形成复合物。因此，这种复合物的蛋白能使特定种类的RNA 标记为“自我”成分而不被识别。

图1 调控抗病毒干扰素产生的信号转导机制简图［10］Fig.1 Diagram of signal transduction mechanism of regulation of antiviral interferon production［10］

2.2 RIG-I/MDA5 通路的转导 RIG-I 的C 末端含有DExD/H-box RNA 解旋酶结构域，N 末端含有两个半胱天冬蛋白酶招募结构域(CARDs)，RIG-I 通过这些结构域诱导I 型IFN 产生。只有RNA 分子能被RIG-I 的RNA 解旋酶结构域有效地识别和展开，并通过CARD 诱导I 型IFN 产生。因而RIG-I的RNA 解旋酶结构域作为一个开关在控制CARD是否暴露并激活下游过程中发挥作用。一旦RIG-I的CARD 激活，通过构象变化而暴露，招募另一个含有CARD 蛋白的IPS-1 作为接头蛋白通过CARDCARD 相互作用。RIG-I 与IPS-1 之间的CARDCARD 相互作用对于dsRNA 诱导的NF-κB、IRF3 和IRF7 的激活非常重要［14］。关于IRFs 的活化，IPS-1通过TRAF3 转导信号通路，TRAF3 参与TLR 激活通路，这样RIG-I-IRF 通路与NEMO 和TANK 作用，促进TBK1 和IKKε 招募，形成IPS-1-TRAF 复合物，该复合物导致TBK1/IKKε 活化，使得IRF3 和IRF7磷酸化，磷酸化的IRF3 和IRF7 形成同源或异源二聚体并转运入核［15］。关于NF-κB 的活化，同TLR3刺激的NF-κB 活化相似，IPS-1 与TRAF2、TRAF6 和RIP1 相互作用，一旦入核，活化形式的IRF3 或IRF7、NF-κB 及AP-1 与其他共转录因子，如CREB结合蛋白(CBP)形成IFN 增强子，产生IFN-β 和IFN-α。

与TLRs 相比，RIG-I 介导的信号通路相对更为重要，敲除不同细胞RIG-I 和TLR 基因表明，RIG-I和TLR 途径调控不同抗病毒信号通路。DCs 和成纤维细胞敲除RIG-I 基因，IFN-β 的诱导能力显著下降，然而浆样DCs 敲除RIG-I 基因，诱导IFN-β 能力没有变化，但缺少MyD88 和TRIF 时有所改变［16］。RIG-I 和TLR 通路以多种方式识别不同类型细胞中的病毒，使宿主更有效地抵抗病毒。除RIG-I 外，MDA5 和LPG2 也具有DExD/H-box RNA解旋酶，与RIG-I 相似，MDA5 的N 末端含有两个CARDs 结构域，促进诱导IFN-β 产生，然而LPG2 缺少CARD 结构域，因而被认为是RIG-I 通路的负调控因子［17］。

3 IPS-1 通路

IPS-1 在调控I 型IFN 产生的信号通路中发挥重要作用，IPS-1 过表达导致IRF3 和NF-κB 激活，诱导I 型IFN 产生。IPS-1 除了含有N 端CARD 结构域，还含有脯氨酸区、锚定在线粒体外膜上的C端疏水跨膜区，突变分析表明CARD 和跨膜区对于维持IPS-1 功能非常重要［18］。IPS-1 的错误定位极大破坏诱导IFNs 能力，暗示线粒体参与先天性免疫。IPS-1 可与Fas 相关死亡结构域作用，直接结合到IKKα 和IKKβ 激酶的C 末端区域，激活NF-κB通路。FADD 和线粒体分别通过招募凋亡因子和释放前凋亡蛋白诱导细胞凋亡，暗示细胞凋亡是先天性免疫反应的一种，IPS-1 可能作为细胞凋亡和I 型IFN 反应的桥梁发挥作用［19］。

4 JAK-STAT 通路

IFN-β 产生后，应答反应进入第二阶段，在此阶段上调数百个基因，参与多种功能。这些基因被称为干扰素刺激基因(ISGs)，JAK-STAT 是调控Ⅰ型IFN 产生信号转导，表达ISGs 的途径。

IFN-α 和IFN-β 与细胞表面的受体结合，启动JAK-STAT 信号通路，受体结合激活Janus 激酶(JAK)和TYK2，使信号转导和转录激活因子1(STAT1)与STAT2 磷酸化。磷酸化的STAT1 和STAT2 与IRF9 形成异源二聚体，形成干扰素刺激基因因子3(ISGF3)复合物，ISGF3 复合物入核，与干扰素刺激反应元件(ISRE)结合，诱导由ISRE 产生抗病毒状态。一旦ISGF3 复合物易位到细胞核，磷酸化的STAT1 和STAT2 发生去磷酸化，重新回到细胞质。JAK-STAT 信号通路由三个STAT 负反馈调节抑制剂调节:抑制细胞因子信号(SOCS)家族通过抑制JAK 与IFN 受体结合，从而抑制STATs 磷酸化;PIAS 蛋白家族包括PIAS1、PIAS3 和PIASy，PIAS1 和PIAS3 分别竞争STAT1 和STAT3 启动子区域内的ISRE，从而抑制ISGs 表达;PIASy 可以召集其他细胞因子抑制STAT1 转录激活［20］。PIAS 不仅为STATs 的负调控子，也是一个SUMO E3 连接酶［21］。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)是小泛素样修饰蛋白，负责许多蛋白质翻译后修饰。泛素样修饰蛋白的修饰过程与泛素化反应相似，一个SUMO 分子通过E3 连接酶特异序列识别，与靶蛋白结合。SUMO E3 连接酶是某些蛋白质泛素化所必需的，调控降解过程。SUMO 通过SENP1 的早期解离增强了STAT1 转录活性，证明SUMO 化修饰对STAT1 活性的负调控作用。SUMO 化修饰通过调节STAT1 的DNA 结合特性参与调控STAT1 反应［22］。

5 IFN 诱导基因及其功能

目前已鉴定出300 多种ISGs，只有几种与诱导细胞骨架重塑的细胞凋亡、转录后调控及翻译后修饰有关，从而建立宿主细胞的抗病毒状态。其他许多ISGs 作为模式识别受体(PRRs)去识别病毒分子或编码转录因子，参与放大信号通路，增加IFN 产生，防止病毒传播。ISG15、RIG-I/MDA5、抗粘病毒A(MxA)、核糖核酸酶L(RNaseL)和蛋白激酶K(PKR)作为抗病毒的效应因子研究最为广泛［23］。

ISG15 为泛素同系物，由ISG15 介导的ISG 化具有调控IFN 产生的功能。ISG15 的C 端含有LRLRGG 序列，由于泛素化作用LRLRGG 序列暴露出来，ISG 化可通过泛素激活酶、泛素结合酶及泛素连接酶与底物结合。泛素激活酶对于ISG15 是特异的，但泛素结合酶和泛素连接酶既可与泛素结合，也可与ISG15 结合。目前已经鉴定至少有158 种ISG15 编码蛋白，其中一些在I 型IFN 产生中发挥重要作用，包括JAK1、STAT1、RIG-I、Mx1 和PKR［24］。与泛素化相似，ISG 化是可逆反应，然而，与Lys48连接泛素的诱导蛋白酶体降解功能不同，ISG 化与K63 连接泛素相似，可招募其他蛋白并调节酶的功能。ISG 化可阻止病毒介导的IRF3 降解，IRF3 也可被大量的分泌到细胞外，作为细胞因子调节免疫反应［25］。

Mx 蛋白属于GTP 酶类，参与细胞内的囊泡转运和细胞器的动态平衡，也是IFN 诱导抗病毒状态的重要组成部分。Mx 蛋白的独特属性是其广泛的抗RNA 病毒活性，包括流感病毒和布尼亚病毒家族的成员。Mx 蛋白具有一个大的N 末端GTP 酶区域，一个中心结构域(CID)和一个C 末端亮氨酸拉链(LZ)结构域，CID 和LZ 结构域识别目标病毒核衣壳结构。正常环境下MxA 蛋白在细胞内膜累积，通过与LZ 和CID 相互作用形成寡聚体。在病毒感染过程中MxA 单体被释放，结合到病毒的核衣壳或其他部位，使其降解［26］。

2'，5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)在细胞内低水平表达，由Ⅰ型IFN 负调控。OAS1 以非活性单体形式在细胞质中存在，一旦被病毒RNA 激活，发生寡聚体化并形成四聚体，四聚体合成2'-5'寡聚腺苷酸(2-5A)，2-5A 与RNaseL 结合触发RNaseL 二聚化，使其切割细胞和病毒RNAs，被切割的RNAs 激活细胞质PRRs，如RIG-I 和MDA5［27］。

PKR 属于蛋白激酶家族，调节蛋白质合成。PKR 在所有组织中以基本水平组成型表达，由Ⅰ型和Ⅲ型IFN 负调控。正常环境下PKR 以灭活的单体形式存在，感染时病毒RNA 引起PKR 构象变化，使ATP 结合到PKR 的C 末端激酶区域激活PKB，激活的PKB 使真核起始因子2α(EIF2α)二聚化和磷酸化，以阻止翻译过程［28］。PKB 的N 末端有两个RNA 结合基序(RBMs)，这些基序通过识别特定的高级结构与RNA 结合。尽管RNAs 只需要16 bp的RNA 与PKB 结合，但是较长的RNA 部分参与RBMs 和PKR 过程，激活激酶功能。大于30 bp 的dsRNAs 可有效地激活PKB，具有5'-三磷酸的47nt的ssRNA 激活PKB 能力非常有限［29］。

ISG15 和MxA 只在IFN 刺激之后产生，OASRNaseL 和PKR 以低水平组成型表达，却在I 型IFN刺激后表达增加。OAS 和PKR 组成型表达表明，这些蛋白不仅作为效应因子发挥作用，而且也可作为dsRNA 特异的PRRs 触发抗病毒反应［30］。

6 结语

先天性免疫是宿主抗病毒感染的第一条防线，Ⅰ型IFN 发挥着重要作用。病毒可操纵TLRs、RIGI/MDA5、IPS-1 和JAK-STAT 等通路来调控IFN 产生，并通过ISGs 调节免疫反应。调控IFN 产生的反应可分为两个阶段，第一阶段主要通过TLRs、RIGI/MDA5 和IPS-1 通路调控IFN-α 和IFN-β 的产生。其中TLR3 通过激活NF-κB、IRF3 和AP-1 等转录因子，诱导IFN-β 基因转录表达，TLR7/8 和TLR9 通过MyD88 启动信号转导，激活IRF7，产生IFN-α;RIG-I/MDA5 通过DExD/H-box RNA 解旋酶结构域和CARD 结构域诱导I 型IFN 产生;IPS-1 的CARD结构域和疏水跨膜区对其发挥功能尤为重要，IPS-1过表达导致IRF3 和NF-κB 激活，诱导I 型IFN 产生。第一阶段产生的IFN 与IFN 受体结合，反应进入第二阶段，激活JAK-STAT 通路，转导IFN 信号通路，诱导MxA、OAS-1/RNaseL、RIG-I/MDA5、ISG15和PKR 等ISGs 的表达，许多ISGs 作为PRRs 识别病毒分子，放大信号通路，增加IFN 产生。深入开展调控I 型IFN 产生的信号转导机制的研究，将有助于更好地了解病毒逃避宿主免疫反应机制。对于病毒性疾病造成的免疫抑制，未来的研究方向可能为鉴定IFN 调节活性位点，应用感染性cDNA 构建基因突变株，消除病毒的免疫抑制功能，更好地控制病毒性疫病的流行。

［1］Takaoka A，Yanai H.Interferon signalling network in innate defence［J］.Cell Microbiol，2006，8(6):907-922.

［2］Randall RE，Goodbourn S.Interferons and viruses:An interplay between induction，signalling，antiviral responses and virus counter measure［J］.J Gen Virol，2008，89 (Pt 1):1-47.

［3］Sang Y，Rowland RR，Hesse RA，et al.Differential expression and activity of the porcine type I interferon family［J］.Physiol Genomics，2010，42(2):248-258.

［4］Granucci F，Zanoni I.Role of Toll like receptor-activated dendritic cells in the development of autoimmunity［J］.Front Biosci，2008，13:4817-4826.

［5］Bartlett NW，Slater L，Glanville N，et al.Defining critical roles for NF-κB p65 and type I interferon in innate immunity to rhinovirus［J］.EMBO Mol Med，2012，4(12):1244-1260.

［6］Vercammen E，Staal J，Beyaert R.Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll-like receptor 3［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(1):13-25.

［7］Unterholzner L，Bowie AG.The interplay between viruses and innate immune signaling:Recent insights and therapeutic opportunities［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(3):589-602.

［8］Saleh MC，Tassetto M，Vanrij RP，et al.Antiviral immunity in Drosophila requires systemic RNA interference spread［J］.Nature，2009，458(7236):346-350.

［9］Edwards MR，Slater L，Johnston SL.Signalling pathways mediating type I interferon gene expression［J］.Microb Infect，2007，9(11):1245-1251.

［10］Yan Sun，Mingyuan Han，Chiyong Kim，et al.Interplay between Interferon-Mediated Innate Immunity and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus［J］.Viruses，2012，4 (4):424-446.

［11］Loo YM，Fornek J，Crochet N，et al.Distinct RIG-I and MDA5 signaling by RNA viruses in innate immunity［J］.J Virol，2008，82(1):335-345.

［12］Fujita T，Onoguchi K，Onomoto K，et al.Triggering antiviral response by RIG-I-related RNA helicases［J］.Biochim，2007，89(6-7):754-760.

［13］Hornung V，Ellegast J，Kim S，et al.5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I［J］.Science，2006，314(5801):994-997.

［14］Bowie AG，Unterholzner L.Viral evasion and subversion of pattern-recognition receptor signalling［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(12):911-922.

［15］O'neill LA，Bowie AG.The family of five:TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling［J］.Nat Rev Immunol，2007，7(5):353-364.

［16］Kenny EF，O'neill LA.Signalling adaptors used by Toll-like receptors:an update［J］.Cytokine，2008，43(3):342-349.

［17］Komuro A，Horvath CM.RNA-and virus-independent inhibition of antiviral signaling by RNA helicase LGP2［J］.J Virol，2006，80(24):12332-12342.

［18］Sen A，Pruijssers AJ，Dermody TS，et al.The early interferon response to rotavirus is regulated by PKR and depends on MAVS/IPS-1，RIG-I，MDA-5，and IRF3［J］.J Virol，2011，85(8):3717-3732.

［19］Seth RB，Sun L，Chen ZJ.Antiviral innate immunity pathways［J］.Cell Res，2006，16(2):141-147.

［20］Wang J，Sun Z，Zhang Z，et al.Protein inhibitors of activated STAT (Pias1 and Piasy)differentially regulate pituitary homeobox 2 (PITX2)transcriptional activity［J］.J Biol Chem，2013，288(18):12580-12595.

［21］Wilkinson KA，Henley JM.Mechanisms，regulation and consequences of protein SUMOylation［J］.Biochem J，2010，428(2):133-145.

［22］Gronholm J，Vanhatura S，Ungureanu D，et al.Structure-function analysis indicates that sumoylation modulates DNA-binding activity of STAT1［J］.BMC Biochem，2012，13:20-31.

［23］Sadler AJ，Williams BR.Interferon-inducible antiviral effectors［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(7):559-568.

［24］Okumura F，Okumura AJ，Uematsu K，et al.Activation of doublestranded RNA-activated protein kinase (PKR)by interferonstimulated gene 15 (ISG15)modification down-regulates protein translation［J］.J Biol Chem，2013，288(4):2839-2847.

［25］Zhao C，Collins MN，Hsiang TY，et al.Interferon-induced ISG15 pathway:an ongoing virus-host battle［J］.Trends Microbiol，2013，21(4):181-186.

［26］Haller O，Staeheli P，Kochs G.Interferon-induced Mx proteins in antiviral host defense［J］.Biochimie，2007，89(6-7):812-828.

［27］Hovanessian AG，Justsen J.The human 2'-5'oligoadenylate synthetase family:Unique interferon-inducible enzymes catalyzing 2'-5' instead of 3'-5' phosphodiester bond formation［J］.Biochimie，2007，89(6-7):779-788.

［28］Nallagatla SR，Toroney R，Bevilacqua PC.Regulation of innate immunity through RNA structure and the protein kinase PKR［J］.Curr Opin Struct Biol，2011，21(1):119-127.

［29］Nallagatla SR，Hwang J，Toroney R，et al.5'-triphosphate-dependent activation of PKR by RNAs with short stem-loops［J］.Science，2007，318(5855):1455-1458.

［30］Takeuchi O，Akira S.Innate immunity to virus infection［J］.Immunol Rev，2009，227(1):75-86.