共抑制分子在脓毒症中的作用研究进展

潘婷婷 刘嘉琳 瞿洪平 (上海交通大学医学院附属瑞金医院重症医学科，上海 200025)

根据Kevin Lafferty 提出的关于T 细胞激活的双信号假说，T 细胞的激活不仅需要MHC-肽-TCR提供的第一信号，而且需要细胞膜上的共信号分子所传递的第二信号。其中共刺激分子传递正性信号促进T 细胞的活化，而共抑制分子将传递负性信号引发T 细胞的无应答、耐受或细胞凋亡。近年研究发现，共抑制分子如程序性死亡因子(PD-1)、细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4(CTLA-4/CD152)及B/T 淋巴细胞弱化因子(BTLA)等在自身免疫性疾病、肿瘤、慢性感染等多种疾病中发挥作用。

脓毒症后期，机体常处于持续的免疫抑制状态［1］，病人往往表现体温降低、白细胞减少，并且容易发生难治的感染。检测脓毒症患者外周血发现［2-4］，多种免疫细胞亚群，如T 淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞上的PD-1、CTLA-4 及BTLA 表达升高，表明共抑制分子在脓毒症中发挥着重要作用。现将对PD-1、CTLA-4 及BTLA 在脓毒症中的作用进行阐述。

1 PD-1

程序性死亡因子(Programmed death-1，PD-1)及其配体［5］属于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成员，它的胞外区为IgV 样结构，胞内区的N 端氨基酸有残基具有ITIM 结构域(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)，通过募集SHP1 及SHP2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1)抑制淋巴细胞的增殖、活化［6］。PD-1 主要表达于活化的CD4+和CD8+T 细胞、NK T 细胞、单核细胞及树突状细胞。PD-1 有两种配体，PD-L1 (B7-H1;CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，两者在表达上存在差异。PD-L1 主要表达于T 细胞、B 细胞、DC、巨噬细胞以及骨髓(BM)衍生的肥大细胞，还可表达在一些非淋巴组织细胞上，如内皮细胞、上皮细胞及胰岛细胞。PD-1 与其配体结合可以抑制细胞活化、细胞因子产生及其细胞毒性作用。而PD-L2 的表达则相对局限，主要表达于DC、巨噬细胞及骨髓衍生的肥大细胞。

以往研究发现［7］，与野生型小鼠相比，PD-1 基因敲除小鼠在盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture，CLP)等诱导的脓毒症模型中存活率明显升高，同时Zhang 等［2］的研究中，在CLP 术前用PD-1 抗体预处理或者术后给予PD-1 抗体，其存活率都比对照组高，表明抗PD-1 对脓毒症有保护作用。

临床中也发现［8］，脓毒症休克患者单核细胞上PD-L1 表达升高，体外阻断PD-1 通路后，用LPS 刺激，促炎因子TNF-α 和IL-6 的分泌均明显增加，而抑炎因子IL-10 的分泌减少。同样用PD-L1 抗体将小鼠体内PD-1 通路阻断［2］，与对照组相比，TNF-α和IL-6 分泌增加，IL-10 的水平下降。单核细胞上PD-L1 的表达可能与其分泌功能减退有关，而这点在脓毒症后期免疫抑制中发挥重要作用。血浆中IL-10 的水平升高往往提示脓毒症休克的预后不佳［9］。检测脓毒症休克病人外周血IL-10 及白细胞PD-1/PD-L1 表达水平发现［10］，IL-10 水平与单核细胞PD-1 的表达水平呈明显正相关，联合检测PD-1及IL-10 的表达可能对脓毒症的预后更有提示作用。

淋巴细胞的凋亡在脓毒症免疫抑制中发挥重要作用，抑制淋巴细胞凋亡可改善脓毒症的预后。Zhang 等［2］研究发现，在脓毒症小鼠中，用PD-L1 抗体处理阻断PD-1 通路，其胸腺淋巴细胞的凋亡比未用PD-L1 抗体处理明显减少，并且比对照组相比，外周血、胸腺及脾脏的淋巴细胞数升高。同样，在体外诱导脓毒症患者外周血淋巴细胞凋亡时发现［8］，阻断PD-L1 可明显减少淋巴细胞凋亡，表明PD-1是淋巴细胞凋亡的重要参与者。脓毒症中淋巴细胞增殖往往受到抑制，研究发现脓毒症患者的淋巴细胞增殖程度与CD4+T 细胞的PD-1 的表达水平呈明显的负相关，因而PD-1 在脓毒症中不仅可以诱导淋巴细胞凋亡而且抑制淋巴细胞增殖。在Brahmamdam 等［11］的研究中发现，阻断PD-1/PD-L1 通路不仅对淋巴细胞有保护作用，对NK 细胞、DC 也有保护作用，说明PD-1/PD-L1 通路不仅调控淋巴细胞的凋亡及增殖，还可能作用于NK 细胞、DC，这有待进一步的研究证实。

严重脓毒症的发展与巨噬细胞功能障碍有密切关系。Huang 等［7］研究发现，在CLP 诱导的脓毒症小鼠中，腹腔巨噬细胞的噬菌能力降低，巨噬细胞PD-1 的表达升高。然而在PD-1 基因敲除的脓毒症小鼠中，其噬菌能力没有降低，表明PD-1 在巨噬细胞的功能障碍中发挥作用。IFN-γ 作为一种重要的炎症因子，可以活化巨噬细胞;巨噬细胞MHCⅡ的表达下降往往预示脓毒症预后不佳。在脓毒症小鼠中发现，将PD-1/PD-L1 阻断，不仅可以逆转真菌血症中IFN-γ 的分泌，而且MHC Ⅱ的表达也有所恢复［12］。

在Ⅰ期临床试验中［13］，PD-1 抗体在黑色素瘤患者中具有较好的耐受性及抗肿瘤活性，PD-1 抗体在脓毒症患者中的临床疗效及安全性尚无临床试验支持。

2 CTLA-4

细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4(CTLA-4/CD152)属于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成员［14］。CTLA仅表达在活化的T 细胞上，在静息和活化初期没有表达。CTLA-4 是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同源二聚体，在Ig 样V 区与CD28 具有相似性。CTLA-4 与CD28 都是抗原递呈细胞表面B7 分子家族(CD80，CD86)的受体，两者与CD80、CD86竞争性地结合，向T 细胞传递抑制或刺激信号，从而抑制或促进T 细胞活化。

Inoue 等［15］研究中，CLP 诱导的脓毒症小鼠T细胞凋亡明显增加的同时，CD4+、CD8+T 细胞上CTLA-4 的表达升高。术后给予CTLA-4 抗体处理发现，CD4+、CD8+T 细胞的凋亡比未给予抗体处理组减少近一半，表明在脓毒症中抗CTLA-4 对T 细胞有保护作用。Roger 等［3］研究发现，脓毒症休克的患者T 细胞的CTLA-4 表达升高，单核细胞表面CD86 表达下降，同时血浆中IL-2 的水平降低。早些研究已经发现，CTLA-4 可以抑制CD3/CD28 诱导的IL-2 的合成［16，17］，而IL-2 可以抑制T 细胞的凋亡。此外，脓毒症休克患者中Treg 细胞的CTLA-4表达升高［18］，表明CTLA-4 可能通过Treg 细胞参与了脓毒症免疫抑制的发生。

用CTLA-4 抗体处理CLP 诱导的脓毒症模型时，低剂量(33 μg/小鼠)时可明显改善生存，但高剂量(200 μg/小鼠)时生存率下降，原因可能是高剂量抗体阻断CTLA-4 引起大量T 细胞活化，从而导致过度的细胞死亡。CTLA-4 单抗易普利姆玛已经经过美国FDA 批准，用于治疗恶性黑色素瘤，然而CTLA-4 抗体在脓毒症中合适的治疗剂量及治疗时间还需要进一步探究。

3 BTLA

B/T 淋巴细胞弱化因子(BTLA)和PD-1、CTLA-4 一样属于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成员［19］，在T 细胞、B 细胞、NK 细胞、DC 及巨噬细胞等表面表达。与PD-1、CTLA-4 不同的是，BTLA 组成性的表达在静止T 细胞上，T 细胞活化后表达逐渐增加，而PD-1、CTLA-4 不表达在静止T 细胞上。BTLA 的配体是肿瘤坏死因子受体家族的疱疹病毒辅助受体(HVEM，herpesvirus entry mediator)，两者结合后传递抑制信号，抑制T 细胞活化和增殖。研究发现［20］，BTLA 在T 细胞活化的起始和早期阶段发挥重要的负性调控作用。

在Kobayashi［21］研究中发现，BTLA 参与IκB-α降解，胞内NF-κB1 及ERK1/2 的磷酸化和RelA 的转位，除此之外，还参与了IRF-3 的转位，因而BTLA可以通过MyD88 及TRIF 通路抑制TLR4 信号。

Shubin 等［4］研究发现，在CLP 诱导的脓毒症中，腹腔巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、成熟及未成熟DC 的BTLA 表达均升高，并且BTLA-/-小鼠与野生型相比死亡率显著降低，肾脏损伤较轻，腹腔细菌负荷量降低，提示BTLA 通过调节固有免疫在脓毒症的发展中发挥作用。进一步证实BTLA 可以影响固有免疫细胞的活化和募集。BTLA-/-小鼠腹腔灌洗液中IL-10 的浓度比野生型低，表明BTLA 不仅可以抑制细胞活化，还可能通过IL-10 促进免疫细胞向免疫抑制状态转化。

4 TIM-3

Th1 型细胞特异性膜蛋白TIM-3［22］，作为特异的Th1 细胞的表面标志，产生抑制信号从而诱导Th1、Tc1 的凋亡。此外，TIM-3 还表达在一些树突状细胞上表达，参与吞噬细胞的凋亡及免疫耐受。脓毒症患者与健康人相比，外周血淋巴细胞TIM-3的表达水平明显升高，提示其在脓毒症中发挥一定作用。然而在严重脓毒症患者中其水平却明显低于脓毒症患者中的水平，表明淋巴细胞TIM-3 的表达水平与疾病严重程度相关。Yang 等［23］的进一步研究发现，巨噬细胞上Tim-3 的过表达可以通过增强PI3K-AKT 磷酸化抑制LPS-TLR4 介导的NF-kappaB的活化，从而负性调控固有免疫反应，所以严重脓毒症中TIM-3 的表达水平降低将不足以抑制其失控的炎症反应，从而引起器官损伤及死亡率的升高。该研究指出严重脓毒症中TIM-3 的表达水平降低可能是由于LPS 的持续刺激引起的。

然而，研究发现［24］，巨噬细胞上TIM-3 一方面可以促进TNF-α、IL-6 的表达增强非特异免疫反应，同时可以通过调节CD80、CD86 的表达增强抗原呈递功能，增强抗炎症反应。Yang 等的研究发现可能是基于脓毒症病人特殊的免疫状态，TIM-3 分子到底在脓毒症中发挥怎样的作用，以及是否可以作为评估疾病严重程度和免疫状态的指标还需要更多的实验证实。

此外，该研究中指出，用抗体拮抗脓毒症小鼠中TIM-3 分子，失控的炎症反应将会继续放大，存活率会明显下降。这一点与PD-1 抗体、低剂量CTLA-4抗体阻断相应通路及BTLA-/-小鼠的脓毒症预后结果相反，考虑与实验动物模型中的免疫状态相关，当机体处于免疫抑制状态时，阻断共抑制分子通路将会刺激免疫反应，利于机体清除病原体，相反当机体处于过度的炎症反应状态时，阻断共抑制分子通路可能会进一步加剧失控的炎症反应，从而造成组织器官的损伤和预后不良。所以，应用共抑制分子治疗脓毒症首先应判断脓毒症患者的免疫状态。

5 结语

本文主要阐明了共抑制分子的表达参与了脓毒症的疾病发展，在动物实验中阻断共抑制分子可以影响脓毒症的预后。但是共抑制分子在脓毒症中具体的作用机制仍不清楚，治疗脓毒症的合适时间及剂量还需要进一步摸索。根据共抑制分子的免疫抑制作用，通过阻断共抑制分子的作用通路，从而缓解脓毒症后期的免疫抑制状态。因此，有理由推测，共抑制分子抗体未来可能辅助脓毒症的免疫治疗。

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