微波固相合成L-瓜氨酸锌螯合物的研究

刘 玲，冯 振，燕 南，牟 杰，刘 毅，郑友广，安 琳，张荣丽

（1.徐州医学院药学院，江苏徐州221004；

2.徐州医学院公共教育学院，江苏徐州221004）

微波固相合成L-瓜氨酸锌螯合物的研究

刘 玲1，冯 振1，燕 南1，牟 杰1，刘 毅1，郑友广1，安 琳1，张荣丽2，*

（1.徐州医学院药学院，江苏徐州221004；

2.徐州医学院公共教育学院，江苏徐州221004）

以L-瓜氨酸和乙酸锌为原料，在固体状态下，通过微波辐射合成L-瓜氨酸锌螯合物。以螯合率为指标，运用单因素和正交实验对影响L-瓜氨酸锌螯合物的合成条件进行了研究，得出最佳反应条件为：碳酸钠添加量15%，微波辐射功率300W，微波辐射时间4min，水分添加量5%；在此工艺条件下，L-瓜氨酸锌螯合物的平均螯合率达到91.1%；红外光谱初步确证了化合物的螯合结构。

L-瓜氨酸锌螯合物，微波，固相合成

氨基酸微量元素配合物具有良好的生物化学稳定性，易被人体吸收，利用率高，无毒副作用，是近年来发展较快的一类新型营养添加剂。L-瓜氨酸是一种首先从西瓜汁中发现的人体内非蛋白质氨基酸，研究表明，瓜氨酸具有重要生理功能，能够清除自由基、抗氧化、舒张血管等，在医药、食品、保健等各个领域广泛应用[1-2]。锌是已知的人体14种必需微量元素之一，由于其在人体内广泛的生理生化作用而被称为“生命元素”[3]。瓜氨酸锌螯合物既能补充人体所必需的微量元素锌又能提供生理活性物质瓜氨酸，并且吸收比单独的补锌制剂好。因此，对L-瓜氨酸锌螯合物合成工艺的研究有着重大意义。

目前，氨基酸金属螯合物合成多采用水相合成法，但该方法存在合成工艺长，三废多，纯化困难，成本高等缺点[4]；而微波辐射技术与传统的加热方法相比，具有反应速度快、产率高及产品易纯化等优点[5]。本实验以L-瓜氨酸与乙酸锌为原料，通过微波辐射固相合成L-瓜氨酸锌螯合物，并探讨了合成最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-瓜氨酸 宁波市镇海海德生化科技有限公司；乙酸锌 江苏徐州化学工业二厂；二甲酚橙 天津市化学制剂研究所；乙二胺四乙酸 上海凌峰化学试剂有限公司。

MAS-Ⅱ型微波炉 新仪微波化学科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 天津市天发科技有限公司；岛津IR-750型红外光谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 瓜氨酸锌螯合物的合成 将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，加入一定量的碳酸钠充分研匀，加适量水作反应引发剂，放至微波炉以不同功率进行反应。用蒸馏水充分洗涤并干燥称重。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 加碱量的确定 将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，添加水分5%混匀，分别添加碳酸钠10%、15%、20%、25%、30%，放置微波炉加热，微波功率400W，微波辐射时间4min，重复实验三次，通过比较螯合率来确定合适的碳酸钠添加量。

1.2.2.2 微波输出功率的确定 将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，添加碳酸钠20%和水分5%后混匀，放置微波炉加热，微波功率分别为100、200、300、400、500W，微波辐射时间4min，重复实验三次，通过比较螯合率来确定合适微波输出功率。

1.2.2.3 微波辐射时间的确定 将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，添加碳酸钠20%和水分5%后混匀，放置微波炉加热，微波功率为400W，微波辐射时间分别为2、3、4、5、6min，重复实验三次，通过比较螯合率来确定合适微波辐射时间。

1.2.2.4 水分添加量的确定 将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，添加碳酸钠20%，分别向其中加入水分2%、3%、4%、5%、6%后混匀，放置微波炉加热，微波功率400W，微波辐射时间4min，重复实验三次，通过比较螯合率来确定合适的引发剂添加量。

1.2.3 正交实验 在单因素实验基础上，将L-瓜氨酸和乙酸锌以2∶1的摩尔比混合，选取加碱量（A）、微波功率（B）、微波时间（C），水分添加量（D）四个因素，采用L9（34）正交实验设计。以螯合率为指标．确定最佳合成条件，因素水平设计见表1。

表1 L9（34）实验因素水平表Table 1 L9（34）Orthogonal factor level table

1.2.4 微量元素螯合率的测定 取制得的瓜氨酸锌0.01g，加20mL水，滴加1mol/L的HCl溶液至完全溶解，用2mol/L的NaOH溶液调节pH到5～6之间。加6mL HAc-NaAc缓冲溶液（pH=5.5）和1～2滴0.5%二甲酚橙指示剂至溶液呈鲜红色。立即用0.01mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定至溶液由红色突变为亮黄色，记录下所用EDTA溶液的体积并计算螯合率。

螯合态Zn元素的摩尔质量=CV×10-3×m/0.01；反应前Zn元素的摩尔质量=M/183.47；

螯合率（%）=（螯合态Zn元素的摩尔质量/反应前Zn元素的摩尔质量）×100

式中，C—EDTA的浓度，为0.01mol/L；V—滴定所用EDTA的体积，mL；m—反应后所得瓜氨酸锌螯合物的质量，g；M—反应前使用原料乙酸锌的质量，g；其中，乙酸锌分子量为183.47。

1.2.3 红外光谱的测定 红外光谱：以KBr压片法，在4000～400cm-1范围内测定瓜氨酸和瓜氨酸锌的红外图谱。

2 结果与讨论

2.1 L-瓜氨酸与乙酸锌的摩尔配比的确定

氨基酸与金属离子的摩尔配比是影响合成的关键因素，如果太小，所得螯合物不稳定；如果过大，螯合物稳定性过高，影响其生物利用度，此外，还会浪费原料。因此，本实验根据文献[6-7]报道的氨基酸与锌离子的配位可能结构（如图1）采用L-瓜氨酸与乙酸锌的摩尔配比为2∶1进行实验，既能保证螯合物结构的相对稳定，又能充分利用L-瓜氨酸。

图1 L-瓜氨酸锌螯合物的分子结构式Fig.1 The structure of L-citrulline chelated zinc

2.2 单因素实验结果

2.2.1 加碱量对螯合反应的影响 采用乙酸锌为原料时，反应副产物是乙酸，具有较高的偶极极化率，如不尽快除去，将造成反应物局部受热过大，引起产物的焦糊、分解。碳酸钠能迅速中和反应过程中产生的副产物酸，调节反应体系的酸碱度，促进反应向正方向进行。作为脱酸剂，它对瓜氨酸锌螯合物的稳定性不产生负面影响，且易于洗涤除去，不影响产物的提取。从实验结果可以看出（图2），随着加碱量的提高，反应螯合率逐渐增加，当添加量为20%时，螯合率达到最大值。继续提高加碱量，反应的螯合率反而下降，这是由于碱性物质的过量加入，在一定程度降低了L-瓜氨酸与乙酸锌之间的接触程度。

图2 加碱量对螯合率的影响Fig.2 Effect of sodium carbonate addition on the chelation ratio

图3 微波输出功率对螯合率的影响Fig.3 Effect of microwave power on the chelation ratio

2.2.2 微波输出功率对螯合反应的影响 微波不同于一般的常规加热，后者一般是由外部热源通过热辐射由表及里的传导式加热，而微波是一种电磁波，具有一定的穿透能力，能对物体进行体内加热。通过提高微波功率可以加强微波的穿透强度，加速反应的进行。结果显示（图3）：微波输出功率对反应的螯合率影响显著。随着微波输出功率的增加，瓜氨酸锌的螯合率也大幅度提高。当微波输出功率为400W时，反应的螯合率达到最大值。但当功率达到能为反应提供足够的能量后，继续增大功率，螯合率快速下降，原因是过高的能量产生瞬时高温，引起产物焦糊，同时副反应增多，引起螯合率下降。

2.2.3 微波辐射时间对螯合反应的影响 微波辐射时间对螯合反应的影响见图4。微波辐射时间低于3min时，反应螯合率低于65%；随着辐射时间的延长，螯合率逐渐升高，在4min左右达到最高值；但微波辐射超过4min，螯合率呈现下降趋势，因此，本反应的最佳辐射时间为4min。

图4 微波辐射时间对螯合率的影响Fig.4 Effect of microwave irradiation time on the chelation ratio

2.2.4 水分添加量对螯合反应的影响 一般物质对微波吸收能力主要是由介电常数和介质损耗角正切来决定的[8]。在固相反应中，适当添加介电常数较大的水分子，能更好地吸收微波，促进反应发生。理论上，引发剂量主要影响初始反应速度，并不影响反应进行的程度[9]，故实验中最佳引发剂水分添加量为5%（见图5）。

图5 引发剂水分的添加量对螯合率的影响Fig.5 Effect of water addition on the chelation ratio

2.3 正交实验结果

按L9（34）进行正交实验，结果见表2，方差分析见表3。各因素对L-瓜氨酸锌螯合率的影响程度大小顺序为：微波辐射时间＞水分添加量＞微波辐射功率＞加碱量。L-瓜氨酸锌螯合物的最佳合成条件为A1B1C2D2，即碳酸钠添加量为15%，微波辐射功率为300W，微波辐射功率为4min，水分添加量为5%。进行三次验证实验，得到螯合率分别为90.2%、91.3%、91.9%，其平均值为91.1%，说明选定条件是稳定的，并且重现性好。

表2 正交实验结果Table 2 Reslult of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

图6 L-瓜b氨酸及L-瓜氨酸锌螯合物的红外图谱Fig.6 IR spectra of L-citrulline and L-citrulline chelated zinc

2.4 产品红外光谱分析

由图6可知，L-瓜氨酸在3361cm-1有由氨基（-NH2）的伸缩振动引起的特征吸收，以及由羰基（-C=O）在1674cm-1伸缩振动引起的特征吸收。当L-瓜氨酸与锌螯合后，氨基的吸收峰移至3398cm-1处；而羰基的吸收值大大增强，特征吸收移至1654cm-1，这是由于瓜氨酸的氨基和羧基氧参与配位形成螫合物的结果。同时，在500cm-1附近没有出现配位水分子的面内和面外摇摆振动峰γ（H2O）和ω（H2O），说明产物中没有配位水分子的存在[10]。螯合物生成后，在2113cm-1处α-氨基酸的特征吸收峰消失，与文献报道结果一致[11]。

其中，L-瓜氨酸锌螯合物的红外数据如下：IR（KBr，cm-1）：3398、3338、3282、3190、2954、2935、2877、1654、1629、1581、1556、1398、1334、1160、1124、1101、644、580。

3 结论

本研究通过微波固相法合成得到L-瓜氨酸锌螯合物，通过红外光谱进行结构分析，初步确证了化合物结构；进一步对化合物合成进行单因素和正交实验分析，确定了L-瓜氨酸锌螯合物的最佳合成条件：碳酸钠添加量15%，微波辐射功率300W，微波辐射功率4min，水分添加量5%，所得L-瓜氨酸锌螯合物平均螯合率为91.1%。

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Study on the synthesis of L-citrulline chelated zinc by microwave in solid state

LIU Ling1，FENG Zhen1，YAN Nan1，MOU Jie1，LIU Yi1，ZHENG You-guang1，AN Lin1，ZHANG Rong-li2，*
（1.The school of Pharamcy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China；2.The School of Basic Education Sciences，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China）

The L-citrulline chelated zinc was synthesized with L-citrulline and zinc acetate as reactants in solid state by microwave.To determine the chelation ratio by single factor and orthogonal experiment，we get the best conditions of reaction：sodium carbonate 15%，microwave power 300W，microwave irradiation time 4min，water 5%.Under the optimal conditions，the average yield of L-citrulline chelated zinc was 91.1%.Meanwhile，the structure of the product was preliminarily confirmed by IR spectrometry.

L-citrulline chelated zinc；microwave；solid state reaction

TS201.2

B

1002-0306（2014）08-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.055

2013－08－02 *通讯联系人

刘玲（1982-），女，硕士研究生，讲师，研究方向：新药设计与药物合成。

徐州市科技计划项目（XF11C065，XZZD1153）；江苏省脑病重点实验室开放课题（Jsbl1104）；江苏省大学生创新训练计划项目（2012JSSPITP1846）；江苏省高校自然科学基金项目（10JKB350005）。