黄芩茎叶提取物纯化方法优选

朱磊李君董海荣王春民

颈复康药业集团有限公司河北省中药新辅料工程技术研究中心，河北承德067000

黄芩茎叶提取物纯化方法优选

朱磊李君董海荣王春民

颈复康药业集团有限公司河北省中药新辅料工程技术研究中心，河北承德067000

目的优选黄芩茎叶提取物的纯化方法，为黄芩茎叶总黄酮的分离纯化提供实验依据。方法以黄芩茎叶总黄酮的转移率、纯度作为考察指标，采用酸沉法、酸碱法、碱溶酸沉、重结晶法4种方法分别对黄芩茎叶总黄酮进行纯化，优化纯化条件，并对纯化结果进行比较。结果4种方法制备的总黄酮的转移率依次为：64%、59%、54%、62%，总黄酮纯度依次为：48%、78%、69%、47%。结论通过对4种纯化方法进行比较可得，酸碱法能提高黄芩茎叶的纯化效果，该研究可以为黄芩茎叶生产中制订合理的纯化方法提供试验依据，对生产具有一定的指导意义。

黄芩茎叶；紫外分光光度法；纯化工艺；正交试验

黄芩为我国华北道地药材之一，为唇形科植物黄芩，又名山茶根、土金茶根。黄芩收载于《神农本草经》、《滇南本草》、《本草正》等，是现代中国药典收载的常用中药。黄芩属于半野生半家种品种，该品种年销量近万吨，为四十种大宗药材品种之一。野生主要分布我国河北、山西北部，内蒙中东部和东北三省大部，河北承德，内蒙古赤峰等几个最具规模的主产区，是我国北方野生中药材的主要品种之一[1]。黄芩多数以根入药。而茎叶大多弃之不用。黄芩茎叶的主要化学成分包括野黄芩苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物[2]。何春年等[3]研究发现，临床所用的黄芩根中主要含有以黄芩总黄酮为主的黄酮类活性成分，而其茎叶也含有黄酮类等有效活性成分。黄芩茎叶具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、保护心肌缺血、降血压、降血糖等药理作用[4-9]。为了更有效地利用中药资源，人们对黄芩茎叶进行提取纯化研究试验，已达到制备高纯度的总黄酮，以满足制剂研究的需要。近年来，研究有关黄芩茎叶总黄酮提取、纯化的方法主要有以酸沉法为主，但纯化方式略有不同，黄芩茎叶总黄酮纯化工艺做了一定的研究，但纯化方法之间没有进行比较，哪个纯化方法更好，结果难以定论。因此，笔者在已有的研究基础上，对黄芩茎叶总黄酮的纯化工艺做了系统的考察和比较。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AL204电子天平（梅特勒-托利多）；KQ-700DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-98-1水浴锅（天津市中环试验电炉有限公司）；TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；FW80型粉碎机（天津市斯泰特仪器有限公司）；，RE-5286A型旋转蒸发仪（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；UV-2401PC紫外可见分光光度计（日本岛津）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2试药

黄芩茎叶药材（颈复康药业集团有限公司中药种植园采摘，经颈复康药业集团有限公司高级工程师张雪荣鉴定为是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分）；野黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110842-201206）；水为二次蒸馏水，甲醇（色谱纯），其余试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩茎叶的提取

称取黄芩茎叶药材1000 g，粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量，提取时间2 h，提取后过滤，合并滤液，浓缩至乙醇无醇味，将浸膏平均分为4份[10-12]，备用。

2.2 黄芩茎叶的纯化方法比较

2.2.1 酸沉法取上述待纯化样品溶液1份，加浓盐酸调pH 3.0～4.0，静置后滤去杂质，在40℃调pH至2.0，保温，静置2 h，过滤，沉淀用水洗至pH为中性，干燥，即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[13]。

2.2.2 酸碱法取上述待纯化样品溶液1份，加浓盐酸调pH 1.0，放置15 h。离心，取沉淀物进行干燥，加水，70℃水浴加热，10%NaOH溶液调至pH 6.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽滤，沉淀用45%乙醇洗涤，滤液加浓盐酸调到pH 1.0，70℃下保温1 h，放置10 h，抽滤，所得沉淀干燥，即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[14]。

2.2.3 碱溶酸沉法取上述待纯化样品溶液1份，加入10%氢氧化钠溶液，调pH至7.5。趁热滤过，滤液加热，缓缓加入20%硫酸溶液，调pH值至2.0，在60℃保温18 min，静置0.5 h，析出棕色沉淀物，倾取上层液，静置20 h后，析出棕黄色沉淀物，分取棕色沉淀物和棕黄色沉淀物，低温干燥，即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[15]。

2.2.4 重结晶法取上述待纯化样品溶液1份，加浓盐酸调pH 2.0，55℃保温6 h，滤过，重结晶，真空干燥，即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.3 黄芩茎叶样品测定结果

以转移率和纯度为考察指标，分别采用酸沉法、酸碱法、碱溶酸沉、重结晶法四种方法，结果见表1。

表1 黄芩茎叶纯化方法的比较（%）

由表1可以得出酸碱法的转移率和纯度比较高，所以笔者选择酸碱法并对之进行优选试验，因素水平设计见表2，结果见表3、4。

表2 因素水平设计

表3 L9（34）正交试验结果表

表4 方差分析表

在预试验的基础上，考察了因素A（碱调pH值）、因素B（活性炭加入量）、因素C（保温温度）、因素D（保温时间）4个因素，以黄芩茎叶总黄酮为评价指标，按正交试验L9（34）表设计试验优化最佳工艺组成和用量，结果见表3。其中极差砸反映各因素对指标影响的程度，极差砸越大，影响程度越大，本试验4个因素砸值排列为A＞B＞C＞D，但各因素对纯化黄芩茎叶总黄酮的影响均不明显（P＞0.05）。由表3数据可知，碱调pH值用量是影响黄芩茎叶总黄酮提取物的主要因素。各因素水平分析结果为A：2＞3＞1；B：3＞2＞1；C：3＞2＞1；D：3＞2＞1，所以本研究选择A2B3C3D3。

2.4 纯化工艺验证

称黄芩茎叶药材2000 g，粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量，提取时间2 h，提取后过滤，合并滤液，浓缩至乙醇无醇味，将浸膏加浓盐酸调pH 1.0，放置12 h。离心，取沉淀物进行干燥，加水，70℃水浴加热，10%NaOH溶液调至pH 7.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽滤，沉淀用45%乙醇洗涤，滤液加浓盐酸调到pH 1.0，80℃下保温1.5 h，放置10 h，抽滤，所得沉淀干燥，即得。结果见表5。

表5 黄芩茎叶提取物纯化结果（%）

2.5 样品含量测定

2.5.1 野黄芩苷对照品溶液的制备精密称野黄芩苷对照品4.25 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使之完全溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度为0.17 mg/mL的对照液，作为对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备取纯化后的黄芩茎叶提取物研细，精密称取10 mg于100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声20 min，待冷却后用甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取2 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.5.3 检测波长的选择取对照品对照液和供试品溶液，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版）在200～400 nm波长范围内扫描，结果显示，二者均在285 nm处有最大吸收，因此选择285 nm作为测定波长。

2.5.4 标准曲线的绘制精密量取上述野黄芩苷对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到系列对照品溶液。以甲醇为空白，采用紫外分光光度法在285 nm下测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，溶液浓度C为横坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程，得回归方程为A=49.172C-0.0075，r=0.9997，结果显示野黄芩苷在0.0064～0.0323 mg/mL浓度范围内呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验精密量取上述野黄芩苷对照品溶液，在285 nm处，以甲醇为空白，按照测定方法进行测定，重复测定6次吸光度，结果对照品溶液的平均吸收度值为0.2996，RSD值为0.52%，精密度较好。

2.5.6 重现性试验取本品100 mg，研细，精密称取9份，分为3组，每组分别为8、10、12 mg，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液；另取对照品溶液，按上述测定方法分别测定野黄芩苷的吸收度，记录吸收度值，计算样品含量。样品平均含量为70.6%，RSD值为1.3%。重现性良好。

2.5.7 稳定性考察取同一批号的供试品溶液，分别在放置0、2、4、6、8 h后，测定其吸收度。结果表明，样品溶液在8 h内稳定性良好，RSD值为0.876%。

2.5.8 回收率试验取本品100 mg，研细，精密称取9份，每份约5 mg，精密加入不同量的野黄芩苷对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按上述测定方法测定各样品的吸收度，计算回收率。结果见表6。

表6 野黄芩苷含量测定加样回收率试验

3 讨论

纵观我国中药资源的开发现状，一方面资源不足，一些蕴藏丰富的资源尚未得到合理开发和利用；另一方面，又存在着严重的浪费和破坏，严重制约了中医药事业的持续稳定发展。如何合理开发利用有限的中药资源，减少中药资源的浪费，关系到中药能否更好地为人类健康服务。药用植物不同部位的开发利用是合理利用有限的中药资源的有效途径之一。中药商品药材按照传统，仅以某些特定部位入药，其余多废弃不用。事实证明被弃部位或含有与入药部位相同的有效成分或有其他药效或用途。黄芩传统上以根部入药，而产量为根部数倍的茎叶则弃之不用，经研究发现黄芩茎叶的主要成分为黄酮类化合物，确定黄芩茎叶黄酮的主要成分为野黄芩苷，并且与黄芩根所含成分（主要成分为黄芩苷）有明显差异。

本试验研究了酸沉法、酸碱法、碱溶酸沉、重结晶法4种方法分别对黄芩茎叶总黄酮进行纯化。得出酸碱法在转移率以及黄芩茎叶总黄酮纯度上均高于其他3种纯化方法。在此基础上利用正交实验得到黄芩茎叶提取物纯化工艺的优化条件，并摸索了比较完整的适合工业化生产的黄芩茎叶总黄酮提取物工艺条件。最佳工艺为称黄芩茎叶药材粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次，每次8倍量，提取时间2 h，提取后过滤，合并滤液，浓缩至乙醇无醇味，将浸膏加浓盐酸调pH 1.0，放置12 h。离心，取沉淀物进行干燥，加水，70℃水浴加热，10%NaOH溶液调至pH 7.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽滤，沉淀用45%乙醇洗涤，滤液加浓盐酸调到pH 1.0，80℃下保温1.5 h，放置10 h，抽滤，所得沉淀干燥，即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。与其他的纯化工艺相比较，其提取成本低廉，工艺简单，适合于工业生产，有一定的实用价值。

[1]普拉.黄芩的主要成分及其药理作用[J].山东畜牧兽医，2014，35（4），76.

[2]郗玉玲，商亚珍.黄芩茎叶的研究进展[J].承德医学院学报，2007，24（3）：293-295.

[3]何春年，彭勇，肖伟，等.黄芩地上部分与根部的化学成分比较研究[J].中国现代中药，2011，13（12）：32-35.

[4]萨其儿，吴香杰.黄芩茎叶的药理作用研究进展[J].中国民族医药杂志，2014，6（6）：51-55.

[5]蔺兆林.黄芩茎叶总黄酮调血脂作用研究[J].内蒙古中医药，2014，33（3）：45.

Optimization of purification for injective extract from Scutellaria baicalensis stems and leaves

ZHU LeiLI JunDONG HairongWANG ChunminJingfukang Pharmaceutical Group the New Excipients of Traditional Chinese Medicine Engineering Research Center of Hebei,Hebei Province,Chengde067000,China

Objective To optimize the method of purifying the extract of Scutellariae baicalensis stems and leaves(SBSL)so as to provide an experimental basis for the separation and purification of total flavonoids of SBSL.Methods Four methods including acid precipitation,acid-alkali method,alkali extraction and acid precipitation,recrystallization method were compared for the optimization of purification of total flavonoids,with the purity rate and transferring rate of total flavonoids as the indexes.Results By using the above-mentioned four methods,the transfer rate of total flavonoids were 64%,59%,54%and 62%;and the purification were 48%,78%,69%and 47%respectively.Conclusion Among the four methods,acid-alkali method shows better purification effect of SBSL,which provides experimental basis for reasonable purification of SBSL,and shows guiding significance for industrial production at large scale.

Scutellaria baicalensis stem leaf;UV spectrophotometry;Purification process;Orthogonal test

Q6.332

A

1673-7210（2014）11（b）-0090-04

国家科技支撑计划项目（编号2011BAI07B04）。