黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

苏丽华 王璇琳 贺 敏 李伟静 任素萍 王春燕 乔志新 丁雪洁 何跃忠▲ 于 群▲

1.中南大学湘雅二医院急诊科，湖南长沙410011；2.军事医学科学院野战输血研究所，北京100850；3.军事医学科学院附属医院急诊科，北京100071

黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

苏丽华1，2，3王璇琳2贺 敏2李伟静2任素萍2王春燕3乔志新2丁雪洁2何跃忠3▲于 群2▲

1.中南大学湘雅二医院急诊科，湖南长沙410011；2.军事医学科学院野战输血研究所，北京100850；3.军事医学科学院附属医院急诊科，北京100071

目的研究黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的保护作用及其机制。方法取大鼠胚胎心肌细胞（H9c2），随机分为5组：正常对照组（C组）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+低、中、高剂量药物组（H/R+ L、M、H组）。流式细胞术检测细胞凋亡、细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）和细胞内活性氧（ROS）产生情况；Western blot方法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2），Bcl-2相关X蛋白（Bax），总丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（tAkt）和磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（pAkt）蛋白表达变化。结果药物组[（H/R+L）组至（H/R+H组）]细胞凋亡比例为（26.7±2.9）%至（6.1±1.1）%，较H/R组[（57.3±10.4）%]明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H/R组比较，药物组ΔΨm升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），ROS水平下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01），Bcl-2及pAkt表达升高，Bax及tAkt表达无明显变化。结论黑青稞籽皮提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用，可抑制心肌细胞凋亡，其可能与Bcl-2/Bax调控和激活磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路有关。

黑青稞；籽皮提取物；心肌细胞；缺氧/复氧；凋亡

心肌缺血再灌注损伤是冠心病、失血性休克及心血管手术中常见的病理损伤，可造成大量心肌细胞凋亡。心肌细胞的缺氧/复氧损伤与缺血再灌注损伤具有极为相似的病理生理机制。心肌的缺血再灌注损伤是一个极其复杂的病理生理过程，目前公认的主要致病机制包括氧化应激损伤、细胞内钙超载、细胞凋亡、细胞能量丧失，中性粒细胞炎性反应激活等。伴随着缺氧/复氧损伤过程产生的大量的自由基[1]，具有很强的化学活性，活跃的电子很容易与细胞的组成物质发生反应，使细胞膜脂质过氧化增强，抑制蛋白质的功能并且破坏核酸及染色体，从而破坏细胞的结构和功能。有效清除自由基，是阻止缺氧/复氧损伤进程的有效途径。花色苷类物质在体外对1，1-二苯基-2苦肼自由基（DPPH·）、超氧阴离子（O2-·）、羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）均具有清除作用，尤其对·OH的清除能力强于抗坏血酸，且清除作用与浓度呈量效关系[2]。

黑青稞是一种生长在高原低温低氧环境中的农作物，其表皮中含有丰富花色苷，黄酮及类黄酮等物质，药理学研究表明，花色苷具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制肿瘤生成等生物学活性[3-4]，笔者在前期动物实验中发现：黑青稞籽皮提取物能够有效延长常压缺氧及断头小鼠的存活时间，说明黑青稞籽皮提取物具有耐缺氧功效；同时，通过细胞学实验结果发现：黑青稞籽皮提取物对心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有良好的保护作用；经过对黑青稞籽皮提取、分离，检测，发现黑青稞籽皮提取物含有主要的花色苷物质为氯化花翠素。为了探讨黑青稞籽皮提取物抗缺氧作用的可能机制，笔者进行了相关实验研究，以期扩展花色苷的应用领域。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞H9c2细胞（购自上海基免生物科技有限公司）。

1.1.2 主要试剂黑青稞籽皮提取物（本实验室提供）；达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Gibco，批号：1237443）；胎牛血清（Hyclone，批号：NXC0582）；连二亚硫酸钠（国药集团，批号：20120413）；C膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒（凯基生物技术发展有限公司，批号：130411）；线粒体膜电位检测试剂盒（编号：C2006）及活性氧检测试剂盒（编号：S0033）（碧云天生物技术研究所）；二辛可酸（BCA）蛋白定量试剂盒（Pierce，批号：OC185139）；抗体：B细胞淋巴瘤白血病-2（Bcl-2）（编号：#2870S），Bcl-2相关X蛋白（Bax）（编号：#2772S），丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt，编号：#4691S），磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（pAkt，编号：#4056S），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，编号：#2118S），均购于Cell Signaling Technology。

1.2 心肌细胞培养

H9c2细胞置于含有15%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，在37℃，5%CO2条件下培养。细胞贴壁生长至铺满80%~85%后，用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 心肌细胞H/R模型的构建与实验分组

采用化学性缺氧法，使用耗氧剂连二亚硫酸钠（Na2S2O4）建立缺氧模型。将Na2S2O4溶于低糖DMEM中，现用现配成终浓度为5 mmol/L Na2S2O4缺氧液。将含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液吸出，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后换上缺氧液，置于5%CO2培养箱内20 min，造成细胞缺氧；将缺氧液换成含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液放置于5%CO2培养箱内培养8 h，使细胞复氧。

分别取正常培养的H9c2细胞随机分为5组：正常对照组（C组）；缺氧/复氧组（H/R组）：按照上述缺氧/复氧模型培养；缺氧/复氧+低、中、高剂量药物组（H/R+L、M、H组）：在复氧同时，在复氧培养基中加入已配制好的黑青稞籽皮提取物使其终浓度为75、150、300 mg/L，余处理同H/R组。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

H9c2细胞按以上分组进行处理后，消化收集所有细胞，用预冷的PBS洗涤2次。加入C膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒中200 μL Binding Buffer重悬细胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI）轻轻混匀，避光室温反应30 min，最后加入300 μL Binding Buffer混匀（Annexin V-FITC和PI终浓度均为1 mg/L），立即上机检测，计算各组细胞凋亡率。

1.5 线粒体跨膜电位（ΔΨm）检测

H9c2细胞按以上分组进行处理后，消化收集所有细胞，PBS洗涤1次。用500 μL培养基重悬细胞后，加入500 μL四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）染色工作液（终浓度为12.5 mg/L），置于37℃孵育30 min，用预冷的染色缓冲液洗涤2次，立即上机检测，计算各组细胞红绿荧光值比例。

1.6 细胞内活性氧（ROS）检测

H9c2按以上分组进行处理（但复氧及给药时间缩短为4 h）后，消化收集所有细胞，PBS洗涤1次。加入用低糖DMEM稀释的2′，7′-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）800 μL（终浓度为10 μmol/L），置于37℃孵育20 min。PBS洗涤细胞2次，立即上机，激发波长488 nm，发射波长525 nm检测各组细胞荧光强度。

1.7 Western blot检测凋亡相关蛋白表达改变

H9c2细胞按以上分组进行处理（但复氧及给药时间缩短为4 h）后，消化收集所有细胞，PBS洗涤2次。向各组加入Western细胞裂解液重悬细胞，低温放置30 min后，离心取上清，进行蛋白定量后，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min变性处理。各组蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），后转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将孵育过一抗和二抗的PVDF膜在Odyssey近红外双色激光成像系统中进行检测，以GAPDH作为内参蛋白。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑青稞籽皮提取物处理对H9c2细胞凋亡的影响

结果显示，C组细胞与H/R组的凋亡细胞所占百分比分别为（5.0±1.1）%和（57.3±10.4）%，药物组中凋亡细胞百分率与H/R组相比呈浓度依赖性降低，从（26.7±2.9）%降低到（6.1±1.1）%[（H/R+L）组至（H/R+H）组]，给药组和H/R组凋亡细胞百分率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且不同剂量药物组间比较，差异有统计学差异（P＜0.05）。说明黑青稞籽皮提取物具有抑制缺氧/复氧损伤细胞凋亡的作用，且具有一定的剂量依赖性（图1，封三）。

2.2 黑青稞籽皮提取物对H9c2细胞线粒体跨膜电位的影响

用荧光探针JC-1对线粒体跨膜电位进行检测，红绿荧光的比例越高，线粒体跨膜电位越高。缺氧/复氧损伤细胞红绿荧光比值为（6.0±0.5），线粒体跨膜电位较C组明显下降。H/R+L、M、H组的黑青稞籽皮提取物处理后红绿荧光比值分别为（8.8±0.7）、（8.6±0.4）和（10.3±0.4），均较H/R组升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），说明黑青稞籽皮提取物处理后线粒体跨膜电位升高（图2，封三）。

2.3 黑青稞籽皮提取物对H9c2细胞内ROS产生的影响

DCFH可被细胞内的活性氧氧化后生成有荧光的2′，7′-二氢二氯荧光黄（DCF），故DCF荧光值强度可反映ROS水平。H/R组DCF荧光强度为（87.7±1.3），较C组（12.0±3.1）明显升高，说明缺氧/复氧损伤心肌细胞内产生大量活性氧。H/R+L、M、H剂量组的黑青稞籽皮提取物处理后DCF荧光强度分别为（46.5±1.6）、（40.5±5.3）和（32.4±3.3），较H/R组明显下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01），说明黑青稞籽皮提取物处理可降低缺氧/复氧细胞内的活性氧水平（图3，封三）。

2.4 黑青稞籽皮提取物对Bcl-2，Bax蛋白表达的影响

和C组比较，缺氧/复氧损伤的细胞Bcl-2表达出现明显下降，各剂量给药组细胞Bcl-2表达低于C组，但明显高于H/R组，其中150 mg/L剂量组Bcl-2表达最高，300 mg/L剂量组次之。而Bax蛋白在各组中均没有出现明显的变化（图4）。

图4 各组细胞Bcl-2家族蛋白表达的水平

2.5 黑青稞籽皮提取物对Akt表达的影响

磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路具有调控细胞代谢、增殖和凋亡的作用，尤其与细胞凋亡的线粒体调控关系密切。Western blotting结果显示，各组中总丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（tAkt）蛋白的表达无显著变化；而H/R组pAkt蛋白表达显著降低，黑青稞籽皮提取物处理后，各剂量组pAkt表达仍低于C组，但较H/R显著升高（图5）。说明缺氧/复氧对tAkt表达无明显影响，但对pAkt具有抑制作用，黑青稞籽皮提取物可能具有重新激活该通路的作用。

图5 各组细胞Akt及Pakt蛋白表达的水平

3 讨论

心肌细胞的缺氧/复氧损伤与缺血再灌注损伤具有极为相似的病理生理机制。缺血再灌注损伤的发生机制涉及到线粒体跨膜电位下降、氧自由基生成、细胞凋亡等。线粒体跨膜电位下降和膜通透性改变导致线粒体内物质转移至胞浆中，引发系列凋亡过程，线粒体解联的呼吸链会产生大量活性氧，而大量的活性氧可以氧化线粒体内膜上的心磷脂，加重线粒体解联，二者相互作用，促进细胞凋亡[5]。ROS是心肌缺血再灌注损伤的主要启动子之一，当凋亡启动后，ROS进一步升高可加速凋亡过程。PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注损伤中起着重要的保护作用[6-7]。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶C末端的Ser473残基被磷酸化激活后，可作用于多种底物，包括Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，抑制细胞凋亡。在本实验中，黑青稞籽皮提取物通过保护线粒体跨膜电位，抑制了活性氧产生，从而减少了活性氧对心肌细胞的损伤作用，这可能与激活PI3K/Akt通路及改变Bcl-2家族蛋白的表达水平密切相关。

通过高效液相色谱检测，黑青稞籽皮提取物中总花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，同时主要存在的天然花色苷物质为氯化花翠素（含量为5.7%）。目前关于花色苷对心肌细胞缺氧/复氧保护作用的研究热点是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[8-9]，而对氯化花翠素相关研究较少[10]。通过本实验笔者认识到，黑青稞籽皮提取物具有良好的心肌细胞保护作用，氯化花翠素是否单独或者协同其他花色苷及类黄酮物质对心肌细胞缺氧/复氧损伤起到保护作用，即明确黑青稞籽皮提取物的功效物质基础是下一步需要解决的问题。另外，黑青稞在耐缺氧/复氧损伤方面与红景天具备一定的相似功效[11-12]。红景天这一珍贵、稀缺的藏药资源是非常有限的，而黑青稞在西藏地区广为种植，在产量上比红景天有明显优势，因此未来有望以天然、绿色、低成本食品来源的天然植物替代珍贵的药用资源，系本研究的意义所在。

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Protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury

SU Lihua1,2,3WANG Xuanlin2HE Min2LI Weijing2REN Suping2WANG Chunyan3QIAO Zhixin2DING Xuejie2HE Yuezhong3▲YU Qun2▲
1.Department of Emergency,the Second Xiangya Hospital of Central South University,Hu′nan Province,Changsha 410011,China;2.Institute of Field Blood Transfusion,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100850,China; 3.Department of Emergency,the Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences,Beijing100071,China

ObjectiveTo investigate the protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and to elucidate its underlying mechanism.MethodsCultured rat cardiac myoblast cells H9c2 were randomly divided into 5 groups:normal control group(C group),hypoxia/reoxygenation injury group(H/R group),and H/R followed by drug treatment with low/median/high dose group(HR+L,+M,+H group).Cell apoptosis, mitochondrial transmembrane potential(ΔΨm)and the generation of intracellular ROS were monitored by flow cytometer.The protein levels of Bcl-2,Bax,tAkt and pAkt in H9c2 cells were observed by Western blot assay.ResultsIt was shown that black barley pericarp extract could reduce the apoptosis rate compared with H/R group cells[H/R group: (57.3±10.4)%,drug treat group(H/R+L)group→(H/R+H)group:(26.7±2.9)%to(6.1±1.1)%,P＜0.05],rescue the loss of mitochondrial transmembrane potential(P＜0.01),and inhibit the production of ROS(P＜0.01).Drug treatments increased the expression levels of Bcl-2 and pAkt rather than H/R group cells,accompanied with no changes in the expression levels of Bax and tAkt.ConclusionBlack barley pericarp extract can protect cardiomyocytes against hypoxia/ reoxygenation injury and suppress the apoptosis of cardiomyocytes,which may relate to Bcl-2/Bax regulation and PI3K-Akt activation pathway.

Black barley;Pericarp extract;Cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation;Apoptosis

R284

A

1673-7210（2014）04（c）-0021-04

2013-10-30本文编辑：卫轲）

苏丽华（1988-），女，中南大学湘雅二医院2011级在读硕士研究生；研究方向：中毒急救。

▲共同通讯作者