尖锐湿疣皮损中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表达

王 薇 肖敬川 王泉江

·短篇论著·

尖锐湿疣皮损中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表达

王 薇 肖敬川 王泉江

目的: 检测尖锐湿疣患者皮损中抗菌肽HBD－2、HBD－3及LL－37mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT－PCR)方法检测56例尖锐湿疣患者皮损和30名正常人皮肤组织中HBD－2、HBD－3及LL－37mRNA的表达。结果: 与正常人皮肤组织相比,尖锐湿疣患者皮损中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表达水平明显升高(P＜0．05)。结论: 尖锐湿疣患者皮损中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA表达水平的上调可能与尖锐湿疣患者局部产生免疫防御有关。

尖锐湿疣； 人乳头瘤病毒； HBD－2； HBD－3； LL－37

尖锐湿疣(condyloma acuminata,CA)是一种由人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的性传播疾病(STD)。本病极易复发,有报道我国复发率达到38%。人β防御素及LL－37是一类可诱导表达的抗菌肽(antimicrobial peptide),在机体的局部直接和间接发挥其免疫防御作用。本实验采用RT－PCR方法检测CA皮损中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表达,探讨其表达的临床意义及其在CA中的防御机制。

1 病例与方法

1．1 病例 2010年1月至2012年12月本院皮肤科门诊经HPV－DNA检测及临床确诊的56例CA患者,其中男34例,女22例。年龄16～74岁,平均28±13．1岁,所有患者均为初发,未接受任何治疗。正常对照组30名,年龄17～65岁,平均31±4．3岁,皮肤标本均为排除包皮龟头炎症的包皮组织。

1．2 标本采集 56例CA患者,均为初发皮损。其中23例为包皮部位皮损,11例为腹股沟区皮损,12例为小阴唇内侧皮损,8例为大阴唇部皮损,2例为肛周皮损。

1．3 方法

1．3．1 总RNA的提取 取皮损标本50 mg加1mL Trizol(美国MBI公司),总RNA提取严格按照试剂盒说明书进行操作。提取出的RNA用紫外分光光度计(美国bio－rad公司)测定其纯度及浓度后,溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)配制的TE水中,－70℃保存以备用。

1．3．2 cDNA的合成 按逆转录试剂盒说明书(美国MBI公司)操作,取备用总RNA 1μL,加Oligo(dT) 181μL,再加去RNA酶的去离子水至总体积为12 μL,混匀后离心3～5 s,70℃孵育5 min后置于冰上,然后按顺序加入5×RT缓冲液4μL,RNA酶抑制剂1 μL。dNTP(10 mmol/L)2μL,37℃孵育5 min后再加入逆转录酶1μL,使终体积达到20μL。42℃反应1 h,70℃10 min终止反应,置于冰上。得到的cDNA－20℃保存或直接行PCR扩增。

1．3．3 PCR扩增 PCR反应总体积为20μL,其中10 ×PCR缓冲液2μL,MgCl2(25 mmol/L)2μL,dNTPs (10 mmol/L)2μL,10 mmol/L上游及下游引物各1 μL,TaqDNA聚合酶1 U,cDNA模板2μL,最后加去离子DEPC水补充到总体积为20μL。扩增条件为: 95℃预变性2 min后按94℃变性20 s,57℃退火40 s, 72℃延伸40 s,共循环31次。HBD－2上游引物:5'－CCAGCCATCAGCCATGAGGGT－3',下游引物:5'－GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA－3',扩增产物片段大小为254 bp。HBD－3上游引物:5'－AGCCTAGCAGCTATGAGGATC－3',下游引物:5'－CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA－3',扩增产物片段大小为206 bp。LL－37上游引物:5'－GAAGACCCAAAGGAATGGCC－3',下游引物:5'－TCAGAGCCCAGAAGCCTGAG－3'。扩增产物片段大小为547 bp。设β－肌动蛋白做内参照物,扩增产物片段大小为150 bp。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应产物于1%琼脂糖凝胶稳压电泳。GOLDVIEWI染色选用DNA Marker I(天根生物公司)作为分子质量标准,以5 V/cm电泳20min,紫外灯下观察结果并摄影。

1．3．4 图像分析 用β－肌动蛋白做内参照,对HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA进行半定量,采用图像分析系统扫描仪(美国bio－rad公司)测定每组标本LL－37、HBD－2,以及β－肌动蛋白扩增产物的电泳条带的灰度值,分别计算出HBD－2、HBD－3及LL－37与β－肌动蛋白的相对比值(即LL－37/β－肌动蛋白,HBD－2/β－肌动蛋白),以此代表HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的相对水平。

1．4 统计学方法 采用SPSS 11．5统计软件分析,所得计量资料采用方差齐性检验后的t检验或校正t'检验。

2 结果

2．1 总RNA纯度及浓度的测定结果 提取的RNA其A260/A280值为1．8～2．0,表明总RNA纯度较好,无污染。

2．2 PCR产物鉴定 HBD－2 mRNA扩增片段为254 bp,HBD－3 mRNA扩增片段为206 bp,LL－37 mRNA扩增片段为547 bp,β－肌动蛋白mRNA扩增片段为150 bp,与理论设计相符(图1～3)。

图1 HBD－2的RT－PCR产物电泳图图2 HBD－3的RT－PCR产物电泳图图3 LL－37的RT－PCR产物电泳图

2．3 RT－PCR产物图像分析 CA患者皮损及正常人皮肤组织中均有HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表达,CA患者皮损中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表达水平较正常人皮肤组织明显增高,差异均有统计学意义(P＜0．05),见表1。

表1 CA患者皮损与正常人皮肤中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA表达水平比较

3 讨论

目前观点认为宿主免疫缺陷可以使易感个体受到HPV的感染。由于乳头瘤病毒在终末分化的表皮细胞内完成复制循环,并通过表皮释放子代病毒,使病毒抗原易于逃逸免疫监视系统,因此,HPV感染比其他的微生物感染更难去除。但是大量免疫正常的宿主感染HPV后最终可以痊愈,这说明许多被感染的宿主可以通过增加有效的免疫应答来抵御HPV感染。

天然表皮、黏膜免疫的重要成分是抗菌肽,目前发现存在于人体皮肤的抗菌肽主要属于两个家族:防御素(defensins)家族和cathelicidin家族。它们具有广谱的抗细菌、抗病毒、抗真菌及抗肿瘤等生物活性。人类防御素可分为α防御素、β防御素(HBD)。HBD－2,3由包括角质形成细胞在内的上皮细胞所产生。LL－37是在人体内发现惟一的cathelicidin家族抗菌肽,主要表达于某些骨髓源性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)、角质形成细胞、组织上皮细胞及某些腺体易与微生物发生接触的部位。有观点认为抗菌肽通过断裂病毒脂质体或影响细胞的信号转导来干扰病毒复制及病毒受体的黏附。1HBD－2由化学因子受体CCR6介导,可在低浓度下趋化记忆T细胞及未成熟树突细胞来参与天然及获得性免疫。2LL－37可破坏病毒的包膜、限制病毒产物的毒性作用及募集炎症细胞以清除病原微生物来发挥杀伤效应,也可通过激活G蛋白偶联受体FPRLs(甲酰基肽受体)对外周血中的中性粒细胞、单核细胞、T细胞具有化学趋化作用,其在表皮抵御微生物进一步侵袭具有重要的保护作用。3－6

本研究结果提示,CA患者皮损局部的抗菌肽HBD－2、HBD－3及LL－37表达上调(P＜0．05),其与皮损部位产生免疫防御有关,人体可通过抗菌肽(HBD－2、HBD－3及LL－37)发挥其天然免疫作用抵御病毒入侵,天然免疫机制又可触发机体产生获得性免疫,但其具体机制尚待进一步研究。

1Selsted ME,Ouellette AJ．Mammalian defensins in the antimicrobial immune response．Nat Immunol,2005,6:551－557．

2Yang D,Chertov O,Bykovskaia SN,et al．β－defensins:linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6．Science,1999,286:525－528．

3 Conner K,Nern K,Rudisill J,et al．The antim icrobial peptide LL－37 is expressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris．JAm Acad Dermatol,2002,47:347－350．

4 De Yang,Chen Q,Sehmidt AP,et al．LL－37,the neutrophil granule－and epithelial cell－derived cathelicidin．utilizes formyl peptide receptor－like 1(FPRLl)as a receptor to ehemoattraet human peripheral blood neutrophils,monocytes,and T cells．J Exp Med,2000,192(7):1069－1074．

5 Scott MG,Davidson DJ,Gold MR,et a1．The human antimicrobial peptide LL－37 is a multifunetionalmodulator of innate immune responses．J Immunol,2002,169(7):3883－3891．

6蔡林,孙青苗．抗菌肽与皮肤疾病关系的研究进展．中国皮肤性病学杂志,2011,1(25):1－5．

(收稿:2013－04－19)

The expression of human beta defensins(HBD)－2,3 and LL－37 in the patients w ith condyloma acum inatum

WANGWei,XIAO Jing-chuan,WANG Quan-jiang.Haikou People's Hospital,Hainan,570208

Objective:To investigate themRNA expression of antimicrobial peptide HBD－2,HBD－3 and LL－37 in the patientswith condyloma acuminatum(CA)．Methods:The skin biopsieswere taken from skin lesions in 56 patientswith CA and 30 normal controls．Reverse transcriptase－polymerase chain reaction(RTPCR)was used to semi－quantitatively analyze themRNA expression of HBD－2,HBD－3 and LL－37 in the tissue samples．Results:ThemRNA expressions of HBD－2,HBD－3 and LL－37 were significant higher in CA than in the normal controls(P＜0．05)．Conclusion:Up－regulated expression of HBD－2,HBD－3 and LL－37 may be related to local immune defense of CA．

condyloma acuminatum；human papilloma virus；human beta defensin－2；human beta defensin－3；antimicrobial peptide LL－37

海南省海口市人民医院,570208