胆囊结石患者主要感染病原菌谱分析

宗春辉，吴尚为，张　辰，李东华，刘洪斌

论著

胆囊结石患者主要感染病原菌谱分析

宗春辉1，吴尚为1，张辰2，李东华1，刘洪斌3

目的：研究胆囊结石主要感染病原菌的分布及特征。方法：对胆囊结石60例，非胆囊结石66例患者手术切除的胆囊、结石和胆汁样本分别行细菌学培养，对主要检出菌做脉冲场凝胶电泳，分析菌株同源性。结果：126例患者共检出88株病原菌，排在前3位的是铜绿假单胞菌，肺炎克雷白杆菌和大肠杆菌，其中铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌在结石组和非结石组的检出率差异有统计学意义，经脉冲场凝胶电泳它们分属不同的型别。结论：胆囊结石患者感染病原菌以革兰阴性菌为主，细菌感染可能参与了胆囊结石的形成。

胆囊结石；细菌感染；分子流行病学；脉冲场凝胶电泳

当胆汁排出受阻时，肠道内的细菌便经血液、淋巴液或逆行进入胆道及胆囊引发急慢性胆囊炎，并可能成为诱发胆囊结石的始动因子。我们对2011年10月—2012年12月126例经腹腔镜手术切除的胆囊、结石和胆汁行细菌学需氧、厌氧培养，并对主要检出菌株行脉冲场凝胶电泳分析，排除院内感染，以期明确细菌感染与胆囊结石形成的关系。

1　材料与方法

1.1临床资料全组共126例，其中胆囊结石60例，年龄为23～69岁，平均45岁；男32例，女28例；非胆囊结石66例（胆囊息肉36例，慢性胆囊炎30例未合并胆囊结石），年龄为30～72岁，平均49岁；男30例，女36例；术前均未预防性使用抗生素，全麻下腹腔镜胆囊切除术后，无菌注射器抽取胆汁5 mL，剪取胆囊黏膜约1.5 cm×1.5 cm置于无菌试管中。胆石组同时收集胆囊结石,测量并记录其大小、数目,用生理盐水冲洗干净。标本放于50mL无菌EP管，即刻接种到细菌培养基。该项目已通过伦理委员会批准并签署知情同意书。

1.2试剂和仪器BAP培养基、MAC培养基购自天津金章公司；LB Broth粉末购于MDBio，Inc公司；厌氧菌培养袋（法国bioMé rieux公司，批号1001017300）；限制性内切酶Spe I、Xba I和λLadder PFGE Marker为New England Biolabs公司产品；溶菌酶，蛋白酶K购自Invitrogen公司；RNase A为Sigma产品；低熔点琼脂糖，PFGE电泳专用琼脂糖均为Bio-Rad公司产品；Microstation快速微生物鉴定系统(美国Biolog公司)；蛋白核酸测定仪购自Eppendorf AG公司；CHEF MAPPERTM型电泳仪、凝胶成像系统购于Bio-Rad公司。

1.3鉴定用Microstation快速微生物鉴定系统进行鉴定，质量控制菌株大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 25923均购自卫生部临床检验中心。

1.4细菌培养需氧菌培养：将胆汁用细菌螺旋接种仪接种于BAP培养基和MAC培养基；胆囊组织内膜经生理盐水洗涤后碾碎，加生理盐水1mL混匀后静置，取上清液用一次性接种环涂于BAP培养基和MAC培养基；结石经生理盐水洗涤后无菌刀片切开，取核心成分碾碎，加生理盐水1mL，混匀后静置5 min，取上清液涂于BAP培养基和MAC培养基，以上均放于37℃培养箱培养24 h。厌氧菌培养：将胆汁、经生理盐水洗涤后的胆囊组织内膜分别接种到厌氧培养皿上（CDC-普通厌氧菌培养皿），放置于厌氧培养袋中，37℃培养箱内培养48～72 h。

1.5脉冲场凝胶电泳挑取LB固体培养基上37℃过夜培养的5～6个菌落转种于20 mL LB肉汤培养液中，37℃水浴摇床过夜。取500μL菌液于1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心2 min。弃上清首先加入500μL PIV，13 000 r/min离心2min，弃上清加入200μL PIV，充分混匀后测定OD600光密度，用公式（40×OD600×210）-210计算出所需PIV量，依次加入1.5 mL离心管中与原菌液混匀。取150μL菌液42℃水浴10min，1.5%低熔点胶42℃水浴，并将两者等体积充分混匀入模具，-20℃5min，室温10min，将胶块切成2～3 mm的小块。将小胶块放入1 mL EC溶菌液中，完全浸没，37℃水浴至少4 h。吸出EC溶菌液加1 mL ES溶液50℃摇床轻摇30 min；吸出ES溶液，加入1 mL ESP溶液50℃消化至少20 h；10 mL TE摇床轻摇30 min，重复5次。将小胶块浸入50 uL的酶切体系（铜绿假单胞菌用约含20 U SpeI酶、肺炎克雷白杆菌用20 U Xba I酶）37℃酶切过夜。制1%PFGE专用凝胶，然后将0.5×TBE洗涤后的酶切胶块15 min，与λLadder Marker同时放入加样孔中，用0.75%的低熔点胶封闭加样孔。电泳条件：温度14℃，电压6 V/cm,角度60°/-60°，电泳时间20 h，脉冲参数：5～15 s，10 h；15～45 s，10 h，线性条件。取10 uL EB染色剂加入200 mL蒸馏水中，混匀后将电泳后凝胶轻轻放入其中，避光轻摇20min，用Gel Doe凝胶成像系统扫描成像仪读胶并应用Quantity One软件分析图像。PFGE图谱按Tenover[1]的分型标准与UPGMA方法（BioRad Quantity One软件）结合进行基因分型。

1.6统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件处理数据,率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1病原菌两组126例患者共获取标本272例（包括胆囊126例，胆汁90例，结石56例），88例标本需氧培养阳性，阳性率32.4%。其中胆囊检出病原菌53株（42.1%），胆汁检出菌31株（34.4%），胆结石检出菌4株（0.7%）。两组患者共检出88株菌，革兰阴性菌86株（97.7%），前3位为铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌；革兰阳性菌2株（2.3%），为屎肠球菌；未发现厌氧菌(见表1)。

表1　病原菌检出情况

2.2主要检出菌前3位菌株在结石组和非结石组的分布如表2所示。不同菌株在两组的检出率进行比较，铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌在结石组培养阳性率比非结石组高（P＜0.05）。在前3位主要检出菌中，胆囊来源的铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌在结石组分别检测到12株、14株、6株，共32株，在非结石组分别为2株、4株、4株，共10株；胆汁来源的铜绿假单胞菌、大肠杆菌在结石组分别检测到6株、2株，共8株，在非结石组为2株、2株，共4株。

2.3铜绿假单胞菌PFGE分型22株铜绿假单胞菌经PFGE分型分为18个型别，即A-R，其中A型2株，C型2株，F型2株，L型2株（见图1）。

表2　结石组和非结石组的主要检出菌

图1　铜绿假单胞菌PFGE分型

2.4肺炎克雷白杆菌菌PFGE分型20株被分为17个型别，即A-Q，其中B型2株，E型2株，P型2株（见图2）。

图2　肺炎克雷白杆菌菌PFGE分型

3　讨论

胆道感染菌株中以革兰阴性菌为主[2]。本文结果显示，铜绿假单胞菌感染有22株占25%，居感染菌的第1位，肺炎克雷白杆菌20株（22.7%）、大肠杆菌16株（18.2%），分别占第2位和第3位。这可能与近年来抗菌药物种类迅速增加及广谱抗生素尤其是头孢菌素的广泛应用有关。

本研究胆汁检出菌31株（34.4%），与以往报道的34.57%相似[3]，且以革兰阴性菌为主，主要包括铜绿假单胞菌菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌等。胆囊黏膜检出菌53株（42.1%），低于以往报道的64%[4]。胆囊黏膜和胆汁细菌检出率高于胆结石，可能由于胆汁和胆囊黏膜检出菌反应的是胆囊切除手术时胆道当时的细菌感染情况，而结石形成需要一个较长的过程，包埋其中的细菌或许早已死亡，所以术中取出的结石常常检测不到活菌株。近年越来越多的研究发现,胆道感染与胆囊结石常为因果关系。1995年，Swidsinski从20例胆固醇结石中扩增到细菌DNA片段,经胆石测序大肠杆菌、梭状芽孢杆菌和痤疮丙酸杆菌分别占25%、35%、45%,使得曾被忽视的细菌在胆固醇结石形成中作用的研究有了新的进展。

以往文献报道，胆道感染中厌氧菌阳性率的高低差异很大,从24%到50%不等，且厌氧菌并不单独引起胆道感染，而是与需氧菌共同存在，导致混合感染。本组病例厌氧菌检出率为0，这除与厌氧菌培养条件高难于检出，胆汁在抽取、运送等过程中厌氧环境可能被破坏等有关外，还需提高厌氧菌检测技术。近年来有报道称，革兰阴性菌的检出率有逐渐降低而革兰阳性菌检出率有逐渐升高的趋势[5]，但目前革兰阴性菌感染仍占有重要地位。在医院临床分离的革兰阴性菌中，铜绿假单孢菌和肺炎克雷白杆菌仍占较高比例，它们是临床分离的主要条件致病菌，也是引起医院内感染的主要病原菌。

在病原菌流行病学调查研究中，病原菌基因分型已被公认为是能够提供病原菌菌株间同源相关性研究的主要依据。其中脉冲场凝胶电泳(pulsed-dield gel electrophoresis，PFGE)是公认的对菌株进行分子流行病学分析的金标准。通过分子分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等流行病学调查有非常重要的意义。本研究结果显示铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌在结石组和非结石组中的检出率有统计学差异，提示它们可能参与了结石的形成。由于肺炎克雷白杆菌和铜绿假单胞菌是院内感染的常见菌株，为了明确这两种菌是否是患者的自身感染菌株并参与了结石的形成，本研究用PFGE对此两种菌株进行了分型，结果显示，这两种菌均为散发感染，即是患者自身携带菌株。Chuang等[6]的研究表明，胆囊黏膜在感染条件下产生的黏蛋白可相互聚集形成胶样或网状结构,成为胆固醇结石和胆色素钙盐沉积的骨架。国内有学者研究发现[7]，克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的内毒素使培养的大鼠胆囊上皮细胞糖蛋白分泌增加,尤以大肠杆菌的作用最强。Koppisetti等[8]发现，感染的胆囊壁及胆汁中氧自由基水平显著升高，刺激胆囊黏膜上皮细胞产生并释放大量黏蛋白。因此,细菌可能在启动成核、破坏胆囊功能、促进胆固醇和钙盐沉积等诸多环节促进结石形成。

本研究结果提示，细菌感染可能参与了胆结石的形成。因此，在临床工作中对各种细菌感染引起的胆道疾病要给予足够重视,对感染细菌及早做出诊断,并应用有效药物进行合理彻底的治疗,以期能阻止胆囊结石的发生或延缓其形成过程。

[1]Tenover FC,Arbeit RD,Goering RV,et al.Interpreting chromosomal DNA restrict ion patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol, 1995,33(9)：2233-2239.

[2]王金凤，常璠.某院普外科胆道细菌感染及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2013,34（3）：322-324.

[3]杨亚敏,阚志超,张富玉,等.胆道感染患者胆汁病原菌培养及药敏分析[J].中华医院感染学杂志，2010,20（21）：3427-3429.

[4]陈广平，朱雷明，蔡端.胆固醇结石患者胆囊细菌感染的研究[J].肝胆胰外科杂志，2007,19（3）：31-33.

[5]Curtis C，Shetty N.Recent trends and prevention of infection in the neonatal intensive care unit[J].Curr Opin Infect Dis，2008，21 (4)：350-356．

[6]Chuang SC,Hsi E,Lee KT.Mucin genes in gallstone disease[J]．Clin Chim Acta,2012,413(19-20)：1466-1471.

[7]王学军，李玉民，李世雄.细菌在胆固醇结石形成中的作用研究[J].中国现代医学杂志，2003,13（3）：12-15.

[8]Koppisetti S,Jeniqiri B,Terron MP et al.Reactive oxygen species and the hypomotility of the gall bladder as targets for the treatment of gallstones with melatonin：a review.Dig Dis Sci,2008,53(10)：2592-2603.

（收稿：2013-10-20修回：2014-08-06）

（责任编辑张淑坤）

Analysis of Microbial Spectrum in Patients with Cholecystolithiasis

ZONG Chun-hui，WU Shang-wei, ZHANG Chen,et al.
Department of Pharmacology,Institute of Acute Abdominal Diseases of Tianjin,Tianjin (300100),China

ObjectiveTo study the distribution and characteristics of main pathogens in specimen of gallbladder stones.MethodsGallbladders,gallstones and bile collected from cholecystectomy were cultured,including 60 patients with cholecystolithiasis and 66 controlled patients without cholecystolithiasis.The homology of the main bacteria isolates was analyzed by pulsed field gel electrophoresis to exclude the hospital infection.ResultsEighty-eight bacteria strains were cultured from 126 patients and the top three strains were Pseudomonas aeruginosa,Klebsiella pneumonia and Escherichia coli.The positive rates of Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumonia in gallstone group were significently higher than that in non gallstone group.The bacteria types were also different as shown by pulsed field gel electrophoresis in two groups.ConclusionThe gram negative bacteria are the main pathogens in patients with gallbladder stones.Bacterial infections may involve in the formation of gallstones.

Cholecystolithiasis;bacterial infection;molecular epidemiology;pulsed field gel electrophoresis

R657.4+2；R37

A

1007-6948(2014)05-0467-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.05.001

1.天津市中西医结合急腹症研究所药理室（天津 300100）

2.天津市南开医院微创外科中心（天津 300100）

3.天津市医药科学研究所（天津 300070）

吴尚为，E-mail：shangwei10021@yahoo.com