重症腹腔结核患者外周血和腹水中Th17细胞及其相关因子的水平和意义

白 婕，张 建，李 莉，李 强，张学丽

重症腹腔结核患者外周血和腹水中Th17细胞及其相关因子的水平和意义

白 婕1，张 建1，李 莉1，李 强1，张学丽2

目的：通过检测重症腹腔结核患者外周血和腹水中Th17细胞及其相关因子的水平，探讨Th17细胞在重症腹腔结核疾病发展过程中的变化。方法：使用流式细胞术检测腹腔结核患者重症期、恢复期以及健康对照组外周血Th17的表达率，ELSIA法检测血清以及腹腔结核重症期、恢复期患者腹水IL-6、IL-17、IL-23水平，分析各组上述指标之间的差异以及各指标间的相关性。结果:腹腔结核重症期组患者Th17细胞所占CD4+T细胞比率和外周血IL-6、IL-17和IL-23水平显著高于恢复期组和健康对照组，患者恢复期组和健康对照组Th17细胞比率和外周血IL-6、IL-17和IL-23水平无统计学差异；腹腔结核患者重症期腹水中的IL-6、IL-17和IL-23均高于其恢复期时腹水中的IL-6、IL-17和IL-23浓度，差异有统计学意义；重症腹腔结核患者Th17细胞和外周血IL-6、IL-17和IL-23呈正相关。结论：Th17细胞及相关细胞因子在腹腔结核重症患者的疾病发展过程中起着一定的调节作用，探索其分化与调控有助于认识它在疾病进展过程中的作用，也有利于生物学治疗靶点的发现。

腹腔结核；Th17细胞；细胞因子

腹腔结核因起病隐匿、临床症状不典型常造成误诊和病情延误，规范的抗痨治疗无效遂发展为重症腹腔结核，危及生命。机体在抵抗结核分枝杆菌感染的过程中,细胞免疫发挥着重要作用。Th17细胞是近年来发现的不同于Th1、Th2和调节性T细胞的一类特殊的新型CD4+T细胞亚群。目前关于Th17研究多集中在自身免疫性疾病，在腹腔结核病中的作用未见报道。我们回顾性分析我院2011年1月—2013年12月3年间重症腹腔结核患者外周血和腹水中Th17细胞及相关因子的水平，探讨Th17在腹腔结核重症患者疾病发展过程中的变化及可能作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 28例在我院手术治疗并经病理学检查证实的腹腔结核患者，平均年龄40岁，男性21例，女性7例；根据“中国结核病诊断标准”，符合重症腹腔结核诊断。术后接受规范抗痨治疗6个月以上，症状逐渐缓解，无发热、腹痛、腹泻，无肠梗阻症状，目前处于恢复期。健康对照组28例，平均年龄34岁，男性15例，女性13例；以上结核病患者均符合中国结核病诊断标准，对入选的结核病患者排除了患有自身免疫性疾病和肺结核。

1.2 实验方法 腹腔结核重症期为第1组，恢复期为第2组，健康对照组为第3组。分别抽取以上各组每人静脉血6 mL，3 mL用于流式细胞术检测Th17细胞，其余3 mL及时分离血清，贮存低温冰箱，用于ELISA法检测IL-6、IL-17、IL-23因子的水平；抽取患者重症期和恢复期腹水各5 mL，ELISA法定量检测IL-6、IL-17、IL-23因子水平。

1.3 试剂和仪器 流式细胞仪购自美国BD公司（FACSCanto），酶免仪为烟台艾德康公司生产全自动酶免工作站。Th17试剂盒购自Biolegend公司，IL-17 ELSIA试剂盒购自Biosource公司，IL-23试剂盒购自Bender Medseestems公司，IL-6试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件，所有数据均采用(±s)表示，多个样本均数的比较用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验，各组间均数差异统计采用配对资料的t检验，相关性分析运用Pearson相关分析方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Th17细胞在CD4+T细胞中的表达情况腹腔结核患者重症期组Th17细胞所占CD4+T细胞比率显著高于患者恢复期组和健康对照组（P＜0.05）；恢复期组和健康对照组Th17细胞比率无统计学差异（详见表1）。

表1 外周血Th17细胞在CD4+T细胞中比率，外周血中IL-6、IL-17、IL-23水平(±s)

表1 外周血Th17细胞在CD4+T细胞中比率，外周血中IL-6、IL-17、IL-23水平(±s)

注：与恢复期组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05

组别重症期组恢复期组对照组n 28 28 28 Th17(%) 1.22±0.19a、b0.82±0.16 0.79±0.17 IL-6(μmol/L) 4.81±0.88a、b4.16±0.58 4.11±0.79 IL-17(μmol/L) 17.22±2.53a、b15.19±2.71 14.78±2.25 IL-23(μmol/L) 90.78±3.71a、b79.03±3.03 77.81±3.69

2.2 细胞因子检测结果 腹腔结核患者重症期的外周血IL-6、IL-17和IL-23高于其恢复期和对照组，差异有统计学意义，恢复期组与对照组比较，差异无统计学意义（详见表1）；腹腔结核患者重症期腹水中的IL-6、IL-17和IL-23均高于其恢复期组的IL-6、IL-17和IL-23浓度，差异有统计学意义（详见表2）。

表2 腹腔结核重症组和恢复期组腹水中IL-6、IL-17、IL-23水平(±s)

表2 腹腔结核重症组和恢复期组腹水中IL-6、IL-17、IL-23水平(±s)

注：与恢复期组比较，aP＜0.05

组别重症期组恢复期组n 28 28 IL-6(μmol/L) 6.84±0.65a4.33±0.19 IL-17(μmol/L) 18.29±2.66a16.22±1.98 IL-23(μmol/L) 94.83±4.27a79.36±4.01

2.3 重症腹腔结核患者Th17与外周血细胞因子相关性分析 Th17细胞和IL-6、IL-17和IL-23呈正相关（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，结核病发病在全球呈上升趋势，我国的形势尤为严峻。人类感染结核菌后，仅有少数人发病，可见机体存在抗结核保护性免疫反应，这种反应以T淋巴细胞介导的细胞免疫反应为主[1]，CD4+T淋巴细胞及其亚群起重要作用。有文献报道，Th1型淋巴细胞在对抗结核分枝杆菌感染中起主要作用[2-3]。一些研究表明，Th17淋巴细胞在结核病的免疫反应中也发挥了重要的作用[4]。Th17细胞是一种新型免疫细胞,来源于CD4+T细胞，具有强大的促炎作用。目前关于Th17细胞的研究多集中在自身免疫性疾病，在结核病中作用机制的研究较少且不明确，在腹腔结核病中的作用未见报道。

腹腔结核是常见肺外结核，部分患者因抗痨治疗无效，逐步发展为重症腹腔结核，导致肠腔狭窄、肠系膜挛缩、腹腔渗出、腹茧症，需要行手术治疗，预后差，危及生命。一方面由于其起病隐匿、临床症状不典型，导致诊断和治疗延误，另一方面，可能因为重症腹腔结核患者免疫系统屏障紊乱，造成抗结核保护性免疫反应抑制，从而使疾病不能有效地控制，逐渐恶化。我们通过检测重症腹腔结核患者外周血和腹水中Th17细胞及其相关因子的水平，观察Th17细胞在腹腔结核疾病发展过程中的变化，分析Th17细胞在腹腔结核重症病例发病机制中的可能作用。

本研究表明，腹腔结核重症期组患者Th17细胞所占CD4+T细胞比率显著高于其恢复期组和健康对照组，而恢复期组和健康对照组Th17细胞比率无统计学差异，说明Th17细胞在重症腹腔结核病的发生发展中可能起一定作用，患者恢复期的Th17水平趋于正常，Th17的变化可能用于疾病转归的判断并预示疾病的治疗效果。

Th17细胞可特征性分泌IL-17，还可分泌肿瘤坏死因子、IL-6以及粒细胞集落刺激因子等。IL-17是一种强大的前炎症因子，可以促进靶细胞分泌一系列炎症因子，上调其他炎症因子基因的表达，还可招募中性粒细胞上调中性粒细胞蛋白酶和髓过氧化物酶等蛋白水解酶的活性。以往的研究提出[5]很多自身免疫性疾病的发病，其机制与Th17细胞及其细胞因子有关。本研究表明，腹腔结核患者重症期组的外周血IL-17高于恢复期组和对照组，差异有统计学意义，且患者重症期腹水中的IL-17水平高于其恢复期腹水中浓度，差异有统计学意义，Th17细胞和IL-17呈正相关。说明本研究组患者IL-17因子主要由Th17细胞产生，与Griffiths等[6]报道相符。

在Th17细胞分化早期，IL-6和TGF-β一起调控其分化，从而维持效应性Th17细胞因子的表达；IL-23可作用于已分化好的Th17细胞，促进其成熟，并起到稳定和维持Th17细胞特性的作用[7]。它虽然不是Th17细胞分化的始动因子，但它是Th17细胞重要的存活因子。本研究中腹腔结核患者重症期组的外周血IL-6和IL-23均高于其恢复期组和对照组，差异有统计学意义，且腹腔结核患者重症期组腹水中的IL-6和IL-23也高于恢复期时腹水中的水平，差异有统计学意义，同样说明IL-6和IL-23在腹腔结核患者Th17细胞升高过程中起到了不容忽视的作用。

尽管抗痨药物的应用在临床取得了很大成效，但是药物对患者的副作用及逐年增多的耐多药结核仍困扰着临床医生。Th17细胞是近年来发现的新型辅助性T细胞，细胞因子IL-17不仅有促炎作用，而且在微生物感染的免疫调节和炎性细胞间的相互调节中具有重要意义。我们通过检测腹腔结核患者重症期和恢复期外周血及腹水中Th17细胞及其相关因子的水平，分析Th17细胞在疾病发展过程中的可能作用。对于Th17细胞的调控可能作为腹腔结核（尤其是耐药腹腔结核）的生物治疗靶点，而Th17细胞及其相关因子水平是否可用于腹腔结核疾病进展和疗效的监测指标有待于进一步研究。

[1]Marín ND,París SC,Rojas M,et.al.Functional profile of CD+4 and CD8+T cells in latently infected individuals and patients with active TB.Tuberculosis(Edinb),2013,93(2)：155-166.

[2]Guo S,Zhao J.Immunotherapy for tuberculosis：what’s the better choice?Front Biosci Landmark Ed,2012,17(1)：2684-2690．

[3]Perreau M,Rozot V,Welles HC,et al.Lack of Mycocobacterium tuberculosis-specific interleukin-17A-producing CD4+T cells in active disease.Eur J Immunol,2013,43(4)：939-948．

[4]Jurado JO,Pasquinelli V,Alvarez IB,et al.IL-17 and IFN-γexpression in lymphocytes from patients with active tuberculosis correlates with the severity of the disease.J Leukoc Biol,2012,91(6)：991-1002.

[5]Maddur MS，MiossecP，Kaveri SV，et al.Th17 cells：biology，pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases，and therapeutic strategies[J].Am JPathol，2012，181(1)：8-18.

[6]Griffiths KL,Pathan AA,Minassian AM,et al.Th1/Th17 cell induction and corresponding reduction in ATP consumption following vaccination with the novel Mycobacterium thberculosis vaccine MVA85A.PLos one,2011,6(8)：e23463.

[7]Caramori G，Lasagna L，Casalini AG，et al.Immune response to Mycobacterium tuberculosis infection in the parietal pleura of patients with tuberculous pleurisy[J].PLoS One，2011，6(7)：226-237.

（收稿：2014-07-16 修回：2014-09-12）

（责任编辑 张静喆）

Detection and Significance of Th17 Lymphocytes and Related Factors in Peripheral Blood and Ascites of Patients with Severe Abdominal Tuberculosis

BAI Jie,ZHANG Jian,LI Li,et al.
Department of Surgery, Tianjin Haihe Hospital,Tianjin(300350),China

Objective To detect Th17 lymphocytes and its related factors in peripheral blood and ascites of patients with severe abdominal tuberculosis and to discuss the changes of Th17 lymphocytes in its process.MethodsThe expression ratio of Th17 in peripheral blood using flow cytometry in patients with abdominal tuberculosis in critical period was determined in convalescence and healthy controls.IL-6,IL-17,IL-23 levels by ELISA in serum of all three groups and in ascites of critical period and convalescence tuberculosis patients were detected.Differences between each set of these indicators and the correlation between the indicators were analysed.ResultsBoth the ratio of Th17 cells sharing CD4+T cells and the levels IL-6,IL-17 and IL-23 in peripheral blood of critical period patients were significantly higher than those in the convalescent patients and healthy controls,the difference between convalescent patients and healthy controls was not statistically significient.The levels of IL-6,IL-17 and IL-23 in ascites in critical period were higher than those in convalescence patients with statistically significant difference.Th17 cell ratio in patients with severe abdominal tuberculosis was positively correlated with the levels of IL-6,IL-17 and IL-23 in peripheral blood.ConclusionTh17 cells and related factors plays a certain regulative function in the development of abdominal tuberculosis in patients with severe disease.Exploration of differentiation and regulation mechanism of the cells helps to understand the role in disease progression and to discover the biological therapeutic targets.

Abdominal tuberculosis;Th17 cells;cytokines

R525

A

1007-6948(2014)05-0477-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.05.004

天津市海河医院1.普外科；2.结核科（天津 300350）

张建，E-mail：xuening_22@126.com