空心李组织培养条件研究

陈卫雪，石开明，李闯，周梦莹，杨秋玲，池政松

（湖北民族学院林学园艺学院，湖北恩施 445000）

空心李组织培养条件研究

陈卫雪，石开明*，李闯，周梦莹，杨秋玲，池政松

（湖北民族学院林学园艺学院，湖北恩施 445000）

[目的]探索空心李实生苗高效再生系统的培养基类型和培养基配方。[方法]以沿河沙子、香蜜空心、红心道、东门3号4个品种的空心李为试验材料，研究空心李组织培养过程中的一些关键技术措施。以4种李成年嫁接树梢尖、带芽茎段为外植体，研究空心李嫁接树营养器官组织培养的主要调控因素及控制外植体微生物污染的措施，建立完整、高效、实用的空心李组织培养快速繁殖体系。[结果]研究结果表明，春季生长的植物体内存在大量生长素、细胞分裂素和赤霉素等生长调节物质，因而组织培养时成活率高、生长快；不同条件的培养结果不同，空心李种子发苗的最佳方案是成熟种子在半固体1/2MS萌发后，转至固体MS上培养；不同外植体的培养结果是带腋芽的茎段繁殖系数大于茎尖，差异达到显著水平；在激素配比中，细胞分裂素6-BA与生长素NAA浓度配比适当时有利于丛生芽的诱导和分化。[结论]最适合空心李幼穗的6-BA浓度为0.5 mg/L，而健壮梢则为1.0 mg/L；NAA浓度以1.0 mg/L为好。

空心李；组织培养；快速繁殖

李子（Prunus salicinaLindl.）为蔷薇科李属植物李果实。李果实清爽味甘甜，具有促进胃酸和酶活性的增加、治疗消化不良的功效，同时具有防氧化、抗衰老的作用，深受人们喜爱。空心李作为李果实重要特色种类之一，其果品色泽鲜艳，营养丰富，脆嫩香酥[1]。据报道，秭归空心李果实的感官性状和理化性质等达到甚至超过许多国内外优良李品种[2]。

空心李的童期比较长，加上雌性器官败育，因为长期杂交繁殖形成了遗传基因组成高度杂合，造成病毒危害非常广泛，目前已知的约有30种病毒易侵染李属果树。常规的扦插或嫁接方法繁殖速度慢、苗质差、易变异，已成为空心李生产发展的制约因素[3]。由于空心李苗木繁殖较易使病毒、病原体传播，扩大病毒寄主范围，从而造成植株长势衰弱、产量减少、品质变劣的品种退化现象，给空心李生产带来严重阻碍。利用植物组织培养进行空心李立体快速繁殖既可克服传统方法的缺点，又能获得具有高度一致而同时具有优良表型的群体。因此，空心李的组织培养在空心李遗传育种、生理生化、培养无病毒苗及快速繁殖无性系等方面的研究都有重要的意义。

关于李组织培养快速繁殖的报道远少于柑橘和苹果。在为数不多的报道中，所使用的材料均为李种子萌发的试管实生苗。目前，我国学者在研究李属植物组培方面的试材已有欧洲李[4]、秭归空心李[5]、紫叶李[6]等。利用传统的方式进行繁殖，存在播种发芽率低、成本高等很多弊端，不能适应市场对良种空心李的大量需求。通过高效组织培养再生体系的建立，能有效克服上述弊端，为空心李的原体苗木快速繁殖、遗传育种、基因转化提供一条新的途径。采用组织培养技术可进行李种质资源创新、缩短育种周期和培育无病毒苗木等。笔者以4个品种的空心李无菌种子、茎尖、茎段为试材，研究空心李茎尖和茎段培养、胚培养、原生质体培养等对芽增殖的影响，旨在为空心李组织培养的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

空心李组织培养快速繁殖系统的建立以沿河、香蜜空心、红心道李、东门3号成熟种子为试材。取自成年空心李树上嫩枝，梢尖、带芽茎段为外植体。

1.2 方法

该试验培养条件为白天25℃，夜晚18℃；光照强度1 000～2 000 lx；光周期L/D=16/8；相对湿度（RH）80%。琼脂用量为6.0 g/L。蔗糖纯度为分析纯，激素浓度单位为mg/L，培养基pH 5.8。相关化学试剂的配制：75%的酒精、0.1%升汞、蒸馏水、MS培养基、1/2MS培养基。茎尖消毒、茎尖的剥离、茎段消毒等技术方法参考文献[7]。

2 结果与分析

2.1 不同类型种子与培养条件对种子萌发及后期分化的影响

将成熟与未成熟种子接种于不加激素的1/2MS、MS的固体和半固体启动培养基上，正交设计不同培养组合与直观分析结果见表1。固体1/2MS培养基是常用于种子萌发的培养基。柚子在种子萌发阶段中，种子在半固体培养基上比固体培养基上更容易启动萌发，这可能与半固体培养基有更好的流动性有关，使种子能与营养成分充分地接触，更容易充分吸收营养。MS培养基作为组培常用的培养基，其上萌发出的无菌苗比l/2MS培养基上萌发的无菌苗更粗壮，这可能与MS含有较高含量的无机元素有关。发苗的最佳方案是成熟种子在半固体1/2MS上萌发后，转至固体MS上培养。

2.2 不同激素组合对诱导不定芽的影响

由表2可以看出，当培养基中添加低浓度的6-BA和NAA时，对外植体的成活率没有显著影响，但随着2种激素浓度的增加，外植体的成活率明显降低，当激素浓度达到最大（6-BA 1.0 mg/L、NAA 1.0 mg/L）时，只有27%～35%外植体出芽。该研究数据表明，在不添加激素的培养基中培养，茎段只有其本身的腋芽原基分化形成的腋芽，均未有新的不定芽生成；在只添加6-BA的情况下，低浓度时，随着6-BA浓度的增加，芽数逐渐增大，6-BA浓度为0.5 mg/L时，总芽数最大可达127个（40个茎段外植体），进一步增加6-BA的浓度时，繁殖系数反而降低；当在培养基中同时添加2种激素时，以6-BA 0.5 mg/L、NAA 0～0.5 mg/L激素配比的培养基繁殖系数最高，与其他处理的差异达到极显著；当只添加NAA时，40株外植体最多产生72个芽，增殖率很低。因此，细胞分裂素6-BA与生长素NAA浓度配比适当时有利于丛生芽的诱导和分化。

2.3 不同外植体的培养对不定芽发生的影响

由表3可知，4种空心李的茎尖和茎段离体培养中，大部分的外植体都能够形成丛生芽，丛生芽生长势较强；其出芽比例受外植体的影响较大，茎段的出芽比例大于茎尖，一般1个茎段可以形成4～5个不定芽，而茎尖段只有2～3个不定芽，差异达到显著水平。

表1 种子萌发的直观分析结果及生长情况

表2 不同激素组合对幼嫩茎段诱导不定芽的影响

表3 不同外植体对不定芽发生的影响

3 结论与讨论

（1）同一品种不同取材部位外植体再生能力不同，沿河沙子和香蜜空心的茎段直接出芽能力均高于茎尖。相关研究海沃德猕猴桃离体繁殖时表明，最初来自根段的茎尖外植体发生侧枝的数量和发生根的数量、长度、干重及鲜重都高于来自茎段的茎外植体和侧芽外植体[8-9]。而该试验对沿河沙子空心李和香蜜空心李的茎段、茎尖外植体直接出芽能力作了分析，结果表明，2份品种均以茎段直接出芽能力最高，更有利于快速繁殖和培养，从远离基部的表面诱导出芽苗的数目较多。

（2）在离体繁殖时，多年生木本植物选择外植体的取材时期非常重要。耿文娟等[4]研究发现，野生欧洲李组织培养条件是5—6月的半年生枝梢为材料效果最好。而该试验中空心李的外植体主要来自于自剪期前后至半木质化的春梢，其次为早秋梢，时间因物候期稍有差异，试验结果基本与耿文娟等研究结果相吻合。这可能一方面与新梢自身的发育状况有关，另一方面也与新梢发育过程中随季节变化体内内源激素种类、含量的变化有关。

[1]杨磊.沿河县沙子空心李栽培技术[J].农技服务，2012（5）：86-87.

[2]邓中美，何正权，陈发菊，等.秭归空心李选育[J].中国林副特产，2007（5）：58.

[3]邹英宁，李国怀.李组织培养研究进展（综述）[J].亚热带植物科学，2005（4）：76-80.

[4]耿文娟，吴玉霞，袁海英，等.野生欧洲李组织培养技术[J].经济林研究，2009（1）：45-50.

[5]邓中美，何正权，陈发菊，等.秭归空心李嫁接苗快速繁育技术研究[J].中国南方果树，2007（2）：71-72.

[6]马志波，王恭祎.紫叶李组织培养及其移植成活率研究[J].林业实用技术，2008（3）：6-8.

[7]张秀丽.欧李组织培养体系试验研究[D].保定：河北农业大学，2007.

[8]张海平，周建峰，任目瑾.海沃德猕猴桃组织培养快速繁育技术研究[J].陕西林业科技，2011（2）：8-11.

[9]吴秀华，张艳玲，周月，等.‘海沃德’猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立[J].植物生理学报，2013（8）：759-763.

（责任编辑 张杨林）

Research on Tissue Culture of Prunus salicina

CHEN Wei-xueet al.(College of Forestry and Horticulture,Hubei Institute for Nationalities,Enshi,Hubei 445000)

[Objective]The aim was to establish a optimal medium type system,optimum medium for efficient regeneration of Prunus salicina seedlings.[Method]Taking mature embryos of Yanhe plum,Xiangmikongxin plum,Honxindao plum and Dongmen3 plum as materials,the key technical measures of tissue culture of Prunus salicina were researched.Moreover,according to four grapefruit trees grafted tip and stems with buds as explants,the main regulatory factors of vegetative organs and tissue culture explants and the measures to control microbial contamination were studied.In following that,a complete practical and efficient grapefruit rapid propagation technology system was established.[Result]The results showed that there were a lot of auxin, cytokinins and gibberellins and other growth regulators,and thus tissue culture high survival rate,fast-growing plants growing in spring.What’s more,it presented different results by different culture conditions.The best solution was culturing on MS after the semi-solid 1/2 MS with mature seeds.Culturing results indicated that the axillary buds propagation coefficient greater than the shoot tips of stems and the differences were significant.It also pointed out that 6-BA and NAA concentration ratio was conducive to the induction and differentiation.[Conclusion]This study showed that the most appropriate 6-BA concentration was 0.5mg/L for tender spike,1.0 mg/L for mature spike,and the NAA concentration was 1.0mg/L as well.

Prunus salicina;Tissue culture;Rapid propagation

S66

A

2095-0896（2014）02-047-03

湖北省教育厅项目（Q20122902）；湖北民族学院林学园艺学院大学生创新项目（LXDC1324）。

陈卫雪（1994-），女，湖北恩施人，本科生，专业：园林。*通讯作者，讲师，博士，从事林学园艺植物遗传育种方面的研究，E-mail：skm331@163.com

2014-01-27