脑缺血再灌注Na+-K+-ATPase损伤作用的实验性治疗初探*

郑新华吴和平孙银银苑广超

脑缺血再灌注Na+-K+-ATPase损伤作用的实验性治疗初探*

郑新华①吴和平②孙银银①苑广超①

目的：探讨尼莫地平和东莨菪碱治疗脑缺血再灌注损伤的作用机理。方法：夹闭双侧颈总动脉和椎动脉复制脑完全性缺血模型。60只家兔均分成六组，假手术组﹑脑缺血组﹑脑缺血再灌注组﹑脑低温治疗组﹑东莨菪碱治疗组﹑尼莫地平治疗组。采集脑和血液标本测量Na+-K+-ATPase﹑超氧化物歧化酶（SOD）﹑丙二醛（MDA）活性。结果：缺血再灌注组脑组织SOD和Na+-K+-ATPase活性降低﹑MDA含量升高；相反，治疗组SOD和Na+-K+-ATPase活性升高，MDA含量降低。结论：东莨菪碱和尼莫地平具有保护缺血再灌注组脑组织Na+-K+-ATPase活性的作用，其机理可能与它们抑制自由基介导的脂质过氧化，减少脂质过氧化物的生成有关。

脑缺血再灌注； Na+-K+-ATP酶； 东莨菪碱； 尼莫地平

脑组织Na+-K+-ATPase对缺血再灌注损伤十分敏感[1]，这在脑复苏领域中一直未引起足够的重视。目前认为再灌注大量生成的自由基介导的膜脂质过氧化是脑缺血再灌注损伤的重要机制[2-4]。本研究试图从这一角度，以头部低温为阳性对照，以东莨菪碱（莨菪碱类药），尼莫地平（Ca2+拮抗剂）为代表药，探讨它们对脑缺血再灌注Na+-K+-ATPase损伤的作用及作用机理，并进一步为莨菪碱类药和Ca2+拮抗剂防治脑缺血再灌注损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组 大耳白兔（湖北省医学实验动物中心提供）60只，体重1.4～1.8 kg，雌雄不拘，实验前禁食12 h，饮水不限，应用25%乌拉坦静脉麻醉，机械通气；监测血气，维持PaCO2于4.32～5.47 kPa。动物均分为六组。假手术组：只做相应的操作，未夹闭血管，不造成缺血再灌注过程；脑缺血组：假手术组+脑缺血30 min；脑缺血再灌注组：脑缺血组+再灌注90 min；脑低温治疗组：脑缺血再灌注+脑低温，即再灌注开始由蠕动泵5 mL/（kg·min）输入经“体外血液降温系统”冷却的血液，再灌注期间（90 min）保持脑温在（26±0.25）℃；东莨菪碱治疗组：脑缺血再灌注组+东莨菪碱，即再灌注开始静脉注射东莨菪碱（广州侨光制药厂）0.2 mg/kg；尼莫地平治疗组：脑缺血再灌注组+尼莫地平，即再灌注开始静脉注射尼莫地平（西德 Bayer Leverkusen 公司生产）60 μg/kg。

各组动物实验期间保持直肠温度在37～38 ℃。再灌注期间平均动脉压维持平均在（11.24±0.25）kPa（与实验前的差异无统计学意义，P＞0.05）。

1.2 脑完全性缺血模型复制 四血管式（夹闭双侧颈总动脉和椎动脉）+低血压法[平均动脉压降至（5.45±0.21）kPa][5-6]。

1.3 选择性脑低温法 按照文献[7]建立自左股动脉﹑左颈总动脉近心端经蠕动泵﹑冰水槽至左颈总动脉远心端的“体外血液降温系统”。在枕叶颅骨钻一小孔，置入针样热敏探头监测脑温。

1.4 标本采集及测量方法 除脑缺血组外（缺血30 min末），其余组在再灌注90 min末（假手术组相应于再灌注90 min末的时间），在动物存活下取适量枕顶皮层，放入液氮中保存，在冰浴下制成脑匀浆并参照文献[8]测量Na+-K+-ATPase活性，超氧化物歧化酶（SOD）﹑丙二醛（MDA），测量方法同文献[5-6]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析，实验数据用（±s）表示，组间均数差异显著性检验用t检验法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织Na+-K+-ATPase活性 以脑缺血再灌注组最低，脑低温治疗组﹑东莨菪碱治疗组和尼莫地平治疗组的Na+-K+-ATPase活性显著高于脑缺血再灌注组（P分别＜0.05和＜0.01），与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）；脑低温治疗组﹑东莨菪碱组和尼莫地平治疗组三组间的Na+-K+-ATPase活性差异无统计学意义（P＞0.05）；见表1。

表1 各组脑组织Na+-K+-ATPase活性、SOD活性、MDA含量比较（±s）

表1 各组脑组织Na+-K+-ATPase活性、SOD活性、MDA含量比较（±s）

*与假手术组比较，P＜0.01；△与脑缺血组比较，P＜0.01；与脑缺血再灌注组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01

组别 Na+-K+-ATPase活性［（μmolPi/（h·mg）］ SOD活性（U/mg） MDA（nmol/mg）假手术组（n=10） 18.60±2.68 1.9935±0.2206 3.23±0.68脑缺血组（n=10） 14.17±2.14 1.8241±0.1516 3.72±0.43脑缺血再灌注组（n=10） 9.80±3.90*△ 0.9715±0.1943*△ 4.67±0.62*△脑低温治疗组（n=10） 14.36±2.97# 1.9538±0.1735▲ 3.38±0.35▲东莨菪碱治疗组（n=10） 16.17±3.58▲ 2.0146±0.1372▲ 3.61±0.47▲尼莫地平治疗组（n=10） 14.75±1.18# 1.9679±0.1641▲ 3.57±0.84▲

2.2 脑组织SOD活性 3个治疗组（脑低温治疗组﹑东莨菪碱治疗组﹑尼莫地平治疗组）的SOD活性接近假手术组，差异无统计学意义（P＞0.05）；高于脑缺血组和脑缺血再灌注组，但与脑缺血组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与脑缺血再灌注组差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.3 脑组织MDA含量 以脑缺血再灌注组最高，脑缺血组次之，但脑缺血组与除脑缺血再灌注组外的其他组间差异无统计学意义（P＞0.05）；脑缺血再灌注组与除脑缺血组外的其他组间差异有显著统计学意义（P＜0.01）；脑低温治疗组﹑东莨菪碱治疗组﹑尼莫地平治疗组的MDA含量变化与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

大量研究证实氧自由基是缺血再灌注损伤的物质基础和启动因子，其介导的膜脂质过氧化而引起生物膜结构破坏﹑功能受损等改变被认为是脑缺血再灌注损伤的重要机制。自由基的结构不稳定，寿命仅几微秒至百分之几秒，直接检测目前较困难。因此本实验与众多文献一样用测量SOD活性和MDA含量间接反映机体清除自由基能力和脂质过氧化程度。

低温[9]﹑莨菪碱类药[5-6]﹑Ca2+拮抗剂均有保护SOD活性[10]﹑抑制自由基介导的脂质过氧化等作用而减轻或改善脑缺血再灌注损伤。研究表明低温还有保护缺血再灌注脑组织Na+-K+-ATPasee的作用[7]。本实验表明东莨菪碱和尼莫地平同低温一样也有保护再灌注脑组织Na+-K+-ATPase活性的作用。

脑Na+-K+-ATPase是位于脑细胞膜上的一种大分子蛋白质，其对缺血再灌注损伤十分敏感的机理还未有深入研究的报道。研究表明磷脂腺丝氨酸和磷脂腺肌醇以及脂肪酸的不饱和程度和链长均影响着Na+-K+-ATPase活性[11-12]。自由基攻击的靶位是不饱和脂肪酸，而人体内的不饱和脂肪酸主要位于生物膜中。显然，Na+-K+-ATPase的这些特性易遭受自由基损害。Sugawara[13]认为再灌注Na+-K+-ATPase损伤的机理可能主要与自由基介导的脂质过氧化物直接抑制酶活性有关。再灌注自由基大量生成的机制主要与黄嘌呤氧化酶有关；Marro[14]研究证实，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇能保护缺氧乳猪脑细胞膜Na+-K+-ATPase活性。Pierr[15]的研究表明，自由基清除剂EGP761能预防脑缺血鼠Na+-K+-ATPase损伤。也有观点认为NO也是一种自由基[16]，它还可以生成毒性更强的OH-和NO2

-，引起蛋白质酪氨酸硝基化反应且使脂质过氧化程度加重，进一步破坏DNA，还可使一些重要酶失活，细胞能量代谢障碍，还参与细胞凋亡的信号通路，加重脑缺血再灌注损伤。但Groenendaal[17]给予NO合成酶抑制剂NNLA未能保护乳猪脑细胞膜Na+-K+-ATPase活性。本实验结果还显示，SOD活性降低，MDA含量升高，Na+-K+-ATPase活性下降，反之，SOD活性升高，MDA含量下降，Na+-K+-ATPase活性升高。提示缺血再灌注脑组织Na+-K+-ATPase损伤与自由基和脂质过氧化含量紧密相关；东莨菪碱和尼莫地平保护缺血再灌注组脑组织Na+-K+-ATPase活性作用的机理可能与它们保护了缺血再灌注时内源性SOD活性，提高机体清除自由基的能力，抑制自由基介导的脂质过氧化作用，减少脂质过氧化物的生成有关。

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医学论文表与图的写作要求

一﹑制表的基本要求

1.重点突出，简单明了，主谓分明，层次清楚。

2.结构完整，有自明性，表的内容不要与文字﹑插图重复。

3.表中的量﹑单位﹑符号﹑缩略语等须与正文一致。

二﹑图应具有自明性，即只看图﹑图题和图例，不阅读正文，就可理解图意；内容不要与文字﹑表格重复；类型应与资料性质匹配。

1.线条图要求线条均匀﹑主辅线分明，并使数轴上刻度值的标法符合数学原则。

2.照片图要求有良好的清晰度和对比度，层次分明，反差适中，没有杂乱的背景。

3.图高度与宽度的比例一般掌握在5∶7左右。

4.图中的量﹑单位﹑符号﹑缩略语等须与正文一致。

The Experiment Therapy of Na+-K+-ATPase Activity Inhibiting in Encephalon Ischemia-reperfusion Injury/

ZHENG Xin-hua， WU He-ping， SUN Yin-yin， et al.// Medical Innovation of China，2014，11（19）：014-016

Objective： To discuss the effect and mechanics of scopolamine and nimodipine in treating encephalon ischemia-reperfusion injury. Method： The ischemia-reperfusion model was made by occluding the rabbits bilateral common carotid artery and vertebral artery. 30 rabbits were divided into normal group， ischemia group， ischemiareperfusion group， hypothermia treatment group， scopolamine treatment group and nimodipine treatment group. Blood samples were collected for assay of superoxide dismutase（SOD）， malonic dialdehyde（MDA） and Na+-K+-ATPase. Result： The SOD and Na+-K+-ATPase activities reduced and the MDA level increased significantly in ischemiareperfusion group. Otherwise， the SOD and Na+-K+-ATPase activities increased and the MDA level decreased in treatment group. Conclusion： Like the low temperature treatment， scopolamine and nimodipine can effectively protect the Na+-K+-ATPase activity in encephalon ischemia-reperfusion injury by inhibiting the reperfusion injury resulting from lipid peroxidation led by free radical.

Encephalon ischemia reperfusion； Na+-K+-ATPase； Scopolamine； Nimodipine

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.19.005

2014-05-22） （本文编辑：郎威）

湖北省卫生厅科研课题（W211704）

①武汉市中医院 湖北 武汉 430014

①湖北省中医院

郑新华

First-author’s address： Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014，China