嗜冷酶的特性及其在食品工业上的应用

王继莲，魏云林，李明源，*

(1.喀什师范学院生物与地理科学系叶尔羌绿洲生态与生物资源研究实验室，新疆喀什844000; 2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500)

在地球这个大的生态系统中，超过80%的地方温度低于5℃，如占地球表面14%的南北两极地区、高山、深海及冰川冻土等，在这些特殊环境中生活着一类特殊的微生物－嗜冷菌［1］。人们也从许多人工高寒环境(如冷库、冰箱)中分离到嗜冷菌。由于长期生活在极冷的环境条件下，嗜冷菌在其细胞内形成了多种具有特殊功能的酶，即嗜冷酶，保证其在低温条件下的生命活力［2］。嗜冷酶不仅具有普通化学催化剂无法比拟的优点，如在低温条件下催化效率高、底物专一性强，且在中高温条件下能快速失活，终止酶作用，这对于食品行业上保持食品的品质尤为有利。目前，对嗜冷酶的研究尚处于初期阶段，但对嗜冷酶的结构特征、嗜冷机制及应用前景已有一些文献报道。本文主要对嗜冷酶的特性及其在食品工业上的应用前景做一综述。

1 嗜冷酶的制备

1.1 利用嗜冷菌和基因工程技术筛选

极端酶的获得需要对极端微生物进行大规模培养和酶的发酵生产。目前嗜冷酶获取的常规手段是从天然的嗜冷环境中采集样品，富集、分离嗜冷菌，再通过特定选择标记筛选嗜冷酶。实验室中通常在低温条件下培养嗜冷菌8～12h，得到较高浓度的细胞和胞外酶，低温下更多的酶生成相应地加快了酶促反应速率。高温(＞25℃)虽然缩短了嗜冷菌的生长时间，但细胞浓度低，胞外酶产量少。研究表明大多数嗜冷菌产生的嗜冷酶在低温条件下依然能保持很高的催化活性，尤其是胞外酶［3］。因此，嗜冷菌依然是目前获得嗜冷酶最直接，也是最可靠的来源。

但是人们对环境的认识有限，大部分的嗜冷菌还未被培养，且多数嗜冷菌生长速度较慢，发酵条件严格，单纯通过培养野生菌来获得大量嗜冷酶极其困难。一般工业生产上直接从嗜冷环境中收集DNA片段，将其随机切割成限制性片段，然后将目的基因导入宿主细胞中表达。这样能够在温和的培养条件下获得大量的嗜冷酶，大大缩短时间，提高筛选效率。利用基因重组技术，克隆极端酶的基因，结合序列分析探讨酶的结构与功能的关系，是目前极端酶酶学研究的方法之一［4－9］。Feller［10］将兼性嗜冷菌Maraxella TA144的脂肪酶基因导入E.coli中表达，获得较高的重组脂肪酶活力，且重组酶与野生酶特性相似。因此，把嗜冷酶基因克隆到嗜温菌中表达，不仅产量高，还能够较好地保持原有的稳定性。

随着DNA测序技术的提高，许多嗜冷菌的基因组已经被解析［11－13］。通过与嗜温菌的已知基因序列比对，可推测得到许多重要的酶蛋白基因序列，对这些基因表达蛋白的研究，将进一步丰富已有的嗜冷酶资源。

1.2 应用定向突变手段筛选

定向进化始于某一基因的克隆，后经体外诱变和重组产生大量的突变体，在中温宿主中表达后，再筛选得到在低温条件下有催化活力的突变体。天然酶的使用局限性促进了蛋白质定向进化技术的快速发展，通过定向诱变和定向突变提高常温酶的稳定性，并对低温酶进行适当的修饰和改造，从而获得新的低温酶是近年来低温酶生物技术的研究方向。定向进化技术的发展不仅为我们获得新型酶提供了新思路，丰富了酶类资源，也促进了许多酶类在工业催化中的应用，利用这种方法已得到多种嗜冷酶［14－16］。

此外，利用DNA改组(DNA shuffling)或杂合酶(hybrid enzyme)技术，将相关基因片段任意重组，合成新的基因库，也有望获得一些新型嗜冷酶，这些技术促进了现在酶工程的快速发展。

2 嗜冷酶的结构特征及耐受机制

嗜冷酶的主要特性，就是在低温下的高周转率(Kcat)和高催化效率(Kcat/Km)［17－18］，这主要受其特殊的结构特征的影响。人们通常采用以下方法研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能:a.通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构比对分析;b.对比同属嗜温、嗜热及嗜冷蛋白的结构，或不同生物中具有不同热稳定性的相同蛋白的结构［19］。现在普遍认为，嗜冷酶通过特定区域或整个蛋白结构柔顺性的提高，降低了自身的活化能，使酶具有较高的底物结合能力，从而降低Km才能在低温下表现出高催化效率，但高柔韧性结构同样也引起酶的耐热性降低。低温酶松散和开放的结构特性，有助于提高酶分子在催化过程中的构象变化能力，一方面为底物到达酶的活性位点提供更佳的通道和容纳位置，提高酶活性位点与底物之间的结合互补性，并有利于产物的释放;另一方面可降低活化能以补偿反应分子的低动能，减少容纳庞大底物所耗费的能量，在低能耗情况下保证酶的高催化效率。

酶蛋白的一级结构决定高级结构，因此从理论上讲，嗜冷酶一级结构的改变对构象的变化及其耐冷机制起主要作用，其微小的变化就会对温度非常敏感，足以引起酶的活性、柔韧性和耐热性的变化，使得底物更容易进入酶活性中心与其结合。嗜冷、嗜温和嗜热3种DNA连接酶的三维模型分析显示，其表面亲水残基含量依次升高(69%、75%、77%)，疏水残基含量依次降低(22%、18%、17%)，中性氨基酸含量也依次降低(21%、18%、14%)，同时，低温连接酶活性位点的表面可接触中性残基含量(20%)也高于其他两种连接酶(18%、9%)，表明嗜冷酶氨基酸残基组成对酶的活性、柔韧性和耐热性具有综合影响［20］。猪α－淀粉酶中的21个脯氨酸残基，在嗜冷酶中有12个发生丢失或被丙氨酸等小分子氨基酸取代［21］;Georlette研究嗜冷、嗜温和嗜热菌的谷氨酰脂脱氢酶(glutamate dehydrogenase)、β－内酰胺酶(β－lactamases)和α－淀粉酶(α－amylase)等的氨基酸，发现其中含较少的脯氨酸、精氨酸残基，脯氨酸与赖氨酸比值也较低;嗜冷磷酸甘油醛异构酶中脯氨酸数量也出现减少［22］。脯氨酸残基可以减小蛋白非折叠多肽构象的自由程度，它们的减少有助于提高蛋白结构的柔顺性;精氨酸含量的减少有利于增强蛋白结构的稳定性，一般表现为精氨酸摩尔比或精氨酸/(精氨酸+赖氨酸)比值的减小［23］。

嗜冷酶的嗜冷机制除与氨基酸的组成及结构有关，还受一些弱键(如静电弱相互作用、离子配位键、氢键、疏水作用)的影响。静电弱相互作用可提供蛋白结构稳定所需的净自由能，离子对(主要为盐桥)是蛋白构象最稳定的因素。人们研究发现，嗜冷酶中缺乏连接二级结构和蛋白域的表面盐桥:与猪胰腺淀粉酶相比，低温α－淀粉酶减少了12个表面盐桥［24］;从嗜热、嗜温到嗜冷丙氨酸脱氢酶，盐桥数量依次递减［25］。氢键也是稳定蛋白折叠构象的一个重要因素，氢键的缺乏减小了非折叠多肽构象的自由程度，提高了蛋白结构的柔顺性［26］。芳香族侧链之间由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的芳香环形成的弱极性相互作用，也是稳定蛋白构象的一个重要因素。Feller［10］研究发现嗜热枯草杆菌蛋白酶、β－内酰胺酶中高度保守的芳香族残基间的一些芳香族相互作用，在嗜冷酶中消失了;低温α－淀粉酶中，氨基、氧基及硫基－芳香族相互作用的数量也出现减少。蛋白核心内部由疏水侧链聚集成簇所形成的疏水核，是稳定蛋白折叠构象的重要力量，其疏水作用可提供蛋白结构稳定所需的净自由能。与嗜温酶相比，嗜冷酶的疏水核心簇内发生了取代，疏水作用急剧下降:猪α－淀粉酶中形成疏水簇的84个残基，在嗜冷酶对应位置上有25个被取代，结果嗜冷酶的疏水能力指数急剧下降，而柔顺性参数则上升了72%［10］;低温β－内酰胺酶、枯草杆菌蛋白酶的整体疏水能力也出现了下降［10］。

此外，溶剂相互作用及表面亲水性［27］、具有独特性质的环状结构的插入/删除、蛋白质的折叠、离子束缚作用(如Ca2+)［28］等也对酶的耐热性有影响。

虽然人们对嗜冷酶进行了一些研究，并且也取得了一些成果，但还不足以彻底阐明酶的结构与耐冷机制之间的关系。从现有的研究结果来看，酶蛋白结构的稳定性、可变性与活性之间的关系是相当复杂的，到目前为止，还没有在嗜冷酶中发现一种或几种与耐冷性有关的模式结构，这说明不同酶以不同的结构类型、同种酶以多种结构变化的总和来维持其在低温条件下的高催化活性。

3 嗜冷酶在食品工业上的应用

目前已有多种嗜冷酶得到了纯化或克隆表达，主要有脂肪酶、弹性蛋白酶、丙氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等。这些低温酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一些优势:低温下催化反应可防止污染(同源的嗜温酶不活泼);经过温和的热处理即可使嗜冷酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质［29］。这也是低温酶能够广泛应用于生物工程的两大要素，尤其在食品工业上，不仅对食物的口感和质量有很好的保持作用，且不用担心酶持续作用改变食物的结构，因此具有较好的应用前景。

3.1 乳制品行业

采用高活性嗜冷β－半乳糖苷酶替代传统的K.luyveromyces产生的β－半乳糖酶，不但可保持高水平的乳糖水解活性，有效降解奶制品中乳糖含量，消除乳糖不耐症，还可缩短水解时间，减少细菌污染的风险，提高奶制品的品质。此外还有脂酶、凝乳酶、过氧化氢酶等。脂酶可用于乳制品和黄油的增香，类可可脂的生产及鱼油中n－3系多聚不饱和脂肪酸含量的提高。乳酪的加工过程中需用凝乳酶，来源于小牛的凝乳酶价格昂贵，且过高的温度会影响奶酪的风味，并耗费较多能量，而稳定性较弱的嗜冷菌凝乳酶有助于解决这一问题。在牛奶冷藏的过程中，需要加入过氧化氢进行杀菌，以避免对牛奶中的酶和有益细菌的损害，而过剩的过氧化氢可以用耐冷的过氧化氢酶来分解。此外还筛选出适于低温条件下(5℃)制作豆奶凝乳的蛋白酶［30］，比采用来自灰菌素链霉菌(Streptomycesgriseinus)的微生物蛋白酶处理过的硬度更高，微生物蛋白酶只产生轻微的凝块活性。

3.2 冷饮行业

低温果胶酶可用来降低果汁的黏度，使终产品变得澄清;β－淀粉酶可部分代替啤酒工艺中的大麦麦芽，降低了啤酒的生产成本，且提高啤酒的香度［31］;对嗜冷酶蛋白结构和稳定性的研究将有利于食品加工中食品的冷冻成型、冷干和浓缩操作等，有望应用于冰淇淋生产中［32］。

3.3 烘烤面包

嗜冷蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶可与淀粉直接作用，改进面团和面包屑的性质，减少生面发酵时间，提高面包质量，同时还可保持香味和水分。这些低温酶的优势不仅体现在其高度专一活性方面，还体现在易失活方面:阻止酶的继续反应，从而避免了面包瓤结构的改变，不至于使面包变得太软或太粘。

3.4 肉类加工行业

低温蛋白酶有助于肉变嫩，因其在低温下可作用于肉类中的结缔组织胶原和弹性硬蛋白，在较低pH状态(pH4～5)下也具有良好的活性，，是理想的肉类柔嫩酶的潜在来源。木瓜蛋白酶已经被应用于这一方面，但直到目前，还没有微生物来源的蛋白酶被成功应用于这一方面，这主要是由于作用于结缔组织的酶活性太低［33］。由嗜冷微生物获得的低温弹性蛋白酶，有可能应用到这方面。

3.5 保健营养品开发

不饱和脂肪酸如PUFA、GLA、EPA及DHA等具有降血脂、降糖、防癌及健脑益智等生理功效，可作为饮食补充物，以补偿必需脂肪酸的不足并恢复正常的代谢功能。但受气候、产地、资源及成本的影响，目前PUFA含量不稳定，不能满足人们的需求。而微生物发酵产生的酶在低温条件下可生物催化合成脂肪酸脂，使其摆脱了原料限制，为油源开发提供新途径。

此外，从嗜碱及嗜冷微球菌(Micrococcussp)中获得一种α－淀粉酶，此酶在低温和高pH下可将淀粉转化为麦芽四糖(mahotetrose)，是一种麦芽寡糖(maho－oligosacch aride)，已被用于食品添加剂和临床分析。

4 展望

随着对嗜冷酶的不断发掘，得到的嗜冷酶种类越来越多，对其特性及应用的研究也越来越深入。就其结构而言，从最初同嗜温、嗜热酶之间同源性模型的结构比对到对其自身晶体三维结构的的观察。目前，许多来源于高山、极地深海等极端环境中的低温酶，包括谷氨酰脂脱氢酶、α－淀粉酶、β－内酰胺酶、丙氨酸脱氢酶等的一级结构、基因或表达蛋白序列功能特性等方面的信息已被获悉。嗜冷酶的结构多样，其嗜冷机制也各不相同，目前尚没有一种统一的模式结构能很好解释嗜冷酶的耐冷机制，尤待我们进一步探索。

从应用方面看，虽然自然界赋予嗜冷酶低温下的高催化活性，且已利用基因工程技术在宿主中得到表达，但酶的表达量毕竟有限，且在高温下的热敏感性限制了其在生物技术上的广泛应用。至今只有一小部分嗜冷酶被分离纯化并应用于生产，因此嗜冷酶还有很大的潜在价值。相信随着越来越多的嗜冷微生物的分离鉴定、嗜冷酶的分离纯化及基因工程技术的进一步发展，嗜冷酶将会以更广阔的来源、更低廉的价格应用到食品行业及其他工业中。

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