贻贝多糖的结构修饰及其体外抗肿瘤活性测定

杜挺挺，陈 荫，钟城城，王晓波，曲有乐

（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316022）

贻贝多糖的结构修饰及其体外抗肿瘤活性测定

杜挺挺，陈 荫，钟城城，王晓波，曲有乐

（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316022）

采用三氧化硫吡啶法对厚壳贻贝多糖（MT1）结构进行硫酸化修饰，并对修饰后多糖进行了体外抗肿瘤活性测定。在样品：三氧化硫吡啶=1:6，温度为90℃条件下反应6 h，实验结果表明：硫酸化多糖（MTS）得率为34%，且修饰后硫酸根含量从6.51%提升到32.95%。体外抗肿瘤活性测定结果显示：浓度为8 mg/mL的MT1、MTS对前列腺癌DU-145细胞作用72 h后的抑制率分别为79.35%、85.04%，且IC50为2.04 mg/mL，1.72 mg/mL；而对人肺癌H1299细胞作用72 h后的抑制率分别为:81.28%、85.32%，以及IC50分别为2.46 mg/mL，1.71 mg/mL。结论：在该条件下修饰后的硫酸化贻贝多糖能提高抗肿瘤活性。

贻贝多糖；硫酸化；抗肿瘤活性

厚壳贻贝为海洋软体动物门双壳纲贝类，又称海红、淡菜，其营养丰富，富含活性物质，在食用和药用上都有很大价值，在舟山海域广泛分布。研究表明贻贝多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降血脂等多种功能活性[1-2]。贻贝多糖活性大小与其结构密切相关，文献表明，一定含量范围内的硫酸根和磷酸根促使多糖具有更高抗肿瘤活性[3-5]。因此对其进行硫酸酯化、磷酸化、烷基化等适当的修饰，可获得具有更高活性的多糖化合物[6-7]。目前国内外对天然修饰的多糖的报道大多来自于菌类、植物中，而从海洋软体动物中，尤其是贝类中提取多糖进行修饰的报道不多[8-10]。为此，本文从新鲜的厚壳贻贝中提取多糖，并进行分离纯化，再通过硫酸酯化修饰。分别从含量，取代度，结构变化以及抗肿瘤活性等方面进行初步研究，结果证明经修饰后的厚壳贻贝多糖活性有所提高，为应用于保健食品与医药等领域提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂

厚壳贻贝多糖（MT1）由本实验室制备；前列腺癌DU-145细胞和人肺癌H1299细胞株购自中国科学院上海细胞所；三氧化硫吡啶、DMF、明胶为 Amresco产品；浓盐酸为市售分析纯试剂;二甲基亚砜；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，上海欧韦达仪器科技有限公司。

1.2 仪器

HH-S型水浴锅，郑州科工贸有限公司；SL-12N型冷冻干燥机，南京顺流仪器有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Necolit5D×B型红外光谱仪，美国傅立叶变换红外光谱仪；高速冷冻离心机，日立公司产品；Forma 3111型CO2恒温培养箱，美国Thermo公司；680型全自动酶标仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 硫酸化修饰

1.3.1.1 硫酸化厚壳贻贝多糖的制备

采用了三氧化硫吡啶法[11-12]对厚壳贻贝多糖进行了酯化，首先取50 mg厚壳贻贝多糖MT1,悬浮于3 mL DMF中搅拌30 min,然后加入0.3 g三氧化硫吡啶,在90℃下均匀搅拌,反应6 h，然后加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀,离心15 min(8 000 r/min)取沉淀,透析(3.5 kDa),冷冻干燥得硫酸化衍生物MTS。

1.3.1.2 硫酸基含量测定

贻贝多糖样品中硫酸基含量的测定,采用氯化钡-明胶比浊法。取样品MT1和MTS各15 mg放入安瓿瓶中,分别加2 mol/L的三氟乙酸2 mL，封管，105℃下加热6 h。吸取0.5 mL水解液在500 nm处测定其吸光度,以无水K2SO4作标准物获得标准曲线后计算得硫酸基含量，取代度(DS)=1.62×S%/(32-1.02× S%)，S%是样品中硫的百分含量。

1.3.2 红外光谱测定

为进一步鉴定厚壳贻贝多糖MT1经硫酸化修饰后的结果，采用红外光谱进行鉴定。

1.3.3 细胞增殖抑制率的测定

采用MTT法[13]，将MT1、MTS分别配置成浓度为0.5 mg/mL，1.0 mg/mL，2 mg/mL，4.0 mg/mL，8.0 mg/mL五个浓度组，分别测定作用24 h、48 h和72 h后,对前列腺癌DU-145细胞株和人肺癌H1299细胞株增殖的影响。

2 实验结果

2.1 结构修饰结果

由硫酸钾标准品制作的标准曲线如图1。

图1 硫酸根含量测定标准曲线Fig.1 Standard carve of sulfate content

在本实验条件下，多糖硫酸化回收率为34%。数据显示，多糖硫酸化产率偏低，其原因可能是高温引起部分多糖被降解成低聚物，在后续处理过程中被透析。此外，高温易引起多糖结构破坏，因此更易产生副反应而降低MTS产量[14]。经氯化钡-明胶法测定，通过标准曲线计算得MT1中硫酸根含量为6.51%，而MTS中硫酸根含量为32.95%，取代度从0.12提升到了0.86。硫酸根含量明显增加。

2.2 红外测定结果

硫酸化后的多糖除了在1 600 cm-1、1 400 cm-1、1 100 cm-1左右有特征吸收峰外，且在1 240 cm-1左右有明显的吸收峰，说明有S=O伸缩振动，证明有硫酸基键存在；同时在850 cm-1附近也有吸收峰，说明C-O-S的伸缩振动，进一步证明存在硫酸基键。红外谱图结果表明：贻贝多糖硫酸化修饰有成果。

2.3 体外抗肿瘤实验结果

2.3.1 MT1、MTS样品对前列腺癌DU-145细胞的抑制作用

本试验测定了MT1、MTS样品对前列腺癌DU-145细胞的增殖抑制作用,在用量和时间等因素考虑对两种细胞生长抑制效率的影响。在一定范围内，随着样品浓度增加，对DU-145癌细胞生长抑制率越高；随着作用时间增长，癌细胞生长抑制率也有所提高，呈现了时效和量效的关系，且硫酸化修饰后多糖抗肿瘤活性相对较好。实验结果如图3～6所示。

图2 MT1、MTS红外谱图Fig.2 IR spectrum of MT1,MTS

图3 MT1、MTS分别添加24h后对DU-145抑制率Fig.3 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 24 h

图4 MT1、MTS分别添加48h后对DU-145抑制率Fig.4 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 48 h

图5 MT1、MTS分别添加72 h后对DU-145抑制率Fig.5 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 72 h

图6 相同添加量MT1、MTS在不同时间对DU-145的抑制率Fig.6 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 in different time

2.3.2 MT1、MTS样品对人肺癌H1299细胞的抑制作用

从图7～10可以看出，在一定范围内，MT1和MTS对肿瘤细胞H1299的抑制作用随样品浓度的增加以及时间的增长而增强，呈现了量效和时效的关系，且添加量的影响作用大于添加时间的影响。此外，图中数据显示，经硫酸化后的多糖MTS的对肿瘤细胞抑制作用强于未修饰的多糖MT1。

图7 MT1、MTS分别添加24 h后对H1299抑制率Fig.7 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 24 h

图8 MT1、MTS分别添加48 h后对H1299抑制率Fig.8 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 48 h

图9 MT1、MTS分别添加72 h后对H1299抑制率Fig.9 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 72 h

图10 相同添加量MT1、MTS在不同时间对H1299的抑制率Fig.10 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 in different time

3 结论

厚壳贻贝多糖的硫酸化与磷酸化同为聚阴离子修饰,国内外对其研究越来越重视。为了得到更多含硫的贻贝多糖化合物可以使活性增加的依据，本实验室通过化学合成的方法得到了厚壳贻贝多糖的衍生物，再通过分别测定未经修饰的贻贝多糖MT1和经化学修饰后的MTS的硫酸根含量，结果显示经修饰后贻贝多糖硫酸根的含量明显提高。最后经MTT法对MT1、MTS进行初步抗肿瘤活性检测，经硫酸化修饰后的贻贝多糖对DU-145和H1299细胞的生长的抑制作用有所提高。在一定含量范围内硫酸基团对多糖抗肿瘤活性起重要作用，为今后贻贝多糖硫酸化及衍生物在功能性食品或药品领域中的应用提供了依据。

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Structure Modification and Research on Antitumor Activity of Mussel Polysaccharide

DU Ting-ting,CHENG Ying,ZHONG Cheng-cheng,et al
(Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Mussel polysaccharide structure wasmodified bysulphur trioxide pyridine,and antitumor activity of Sulfated polysaccharides was investigated in vitro.The condition of Sulfuric acid esterification experiment was that:the quality proportion of sample and sulphur trioxide pyridine was 1:6,reaction temperature was 90℃and reaction time was 6h.It showed that:the yield of sulfated polysaccharide(MTS)was 34%,and the content of SO42-was improved from 6.51%to 32.95%.Antitumor activity test in vitro showed that:inhibitory effect of MT1, MTS on DU-145 was 79.35%,85.04%,and IC50was 2.04mg/mL，1.72mg/mL.The inhibitory effectno H1299 was 81.28%,85.32%and IC50was 2.46 mg/mL,1.71mg/mL.Conclusion:Sulfated polysaccharide can improve the antitumor activity.

mussel polysaccharide;sulfating;antitumor activity

S284

A

1008－830X(2014)04－0354－04

2014-03-20

浙江省科技厅项目（2010R50029-19）

杜挺挺（1991-），女，浙江东阳人，硕士研究生，研究方向：天然药物提取.E-mail:714716887@qq.com

曲有乐（1960-），男，教授，研究方向：天然药物活性结构改造与设计.E-mail:youle1960@163.com