豆瓣酱发酵种曲红曲霉LLMY-18的筛选分离

卢生有，刘秀梅，马洪菲，杨翔华，王战勇

（辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁抚顺113001）

豆瓣酱发酵种曲红曲霉LLMY-18的筛选分离

卢生有，刘秀梅，马洪菲，杨翔华*，王战勇

（辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁抚顺113001）

从麦芽汁培养基中利用籼米分离菌株，通过平板筛选和固体培养的方法，筛选分离获得一株优质、稳定、高产、周期适合的红曲霉菌株LLMY-18。此菌株在发酵周期和发酵条件方面与豆瓣酱所需的条件相似，产红色素的能力大大提高，可将其应用到豆瓣酱的加工生产中。初步表明，红曲霉LLMY-18参与发酵制成的红曲豆瓣酱具有色泽红润、口感醇厚、味道鲜美等优点。

红曲霉；筛选；豆瓣酱

红曲霉是以籼米为原料，在传统基础上，通过菌种纯化平板分离筛选方法精致而成。红曲霉可作为食品染料加入发酵的食品中，如肉、饮料、蔬菜及大豆凝乳中[1]，并具有良好的治疗性能，可以利用其促进色素的合成[2-3]，其中的有些成分对健康十分有益，如对“三高”的防治和抗细胞肿瘤癌等作用[4]。在对红曲霉的深入研究过程中，其被发掘出来的药用价值也被应用在医药和食品等多个行业中[5]。与已知的天然色素相比，其在具有天然色素的一般特性的同时又具有较强的耐热性、稳定性与对蛋白质良好的着色性等优点[6]。

本研究的目的是欲将其应用到豆瓣酱中，在满足传统豆瓣酱的形、香、味方面的同时，突出了红曲霉的色，同时也更有利于健康。

1 材料、设备与方法

1.1 原料

麦芽粉、玉米粉、黄豆芽、籼米、琼脂、豆饼、大米、乙醇、乳酸。

1.2 设备

SHP-1500生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；LDZX-40KB立式电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ALC-210.4电子分析天平；SL-219A冷藏柜（4℃）；DZF一6020型真空干燥箱；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 培养基

1.3.1 麦芽汁培养基

称取适量的麦芽粉，用3倍重量的水（55℃～60℃）进行调浆，然后放置在水浴箱中糖化3.5 h～5.5 h。将煮沸的液体用双层纱布进行过滤，得到麦芽汁，调节pH为3.5～3.8。在121℃下灭菌20min。

1.3.2 麦芽汁琼脂培养基

取一定量麦芽汁，调pH为5.0～5.8，加2%（W/V）琼脂，熔化后于121℃灭菌20min。

1.3.3 黄豆芽培养基

取80 g黄豆芽，加水煮沸20 min，过滤，定容至800mL，加入葡萄糖30g，灭菌，再加50%的乙醇6mL。

1.3.4 马铃薯培养基

配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入磷酸二氢钾2.5 g，硫酸镁15 g，琼脂20 g，葡萄糖22 g，VC8mg，加热溶解后补足水分，调整pH到6。

1.3.5 发酵培养基

豆饼粉10 g，加水混匀，于121℃糊化55min，冷却至50℃，加淀粉酶3g糖化15min。再加0.3g（NH4）2SO4、0.1 gMgSO4、0.2 gK2HPO4，加水定容至100mL，调pH为5.0～6.0，然后于121℃灭菌30min。

1.3.6 孢子培养基

将25 g大米泡5 h后加入20mL水，于121℃灭菌20min。

1.4 方法

1.4.1 菌种来源

取麦芽汁分装入3支试管中（5mL/管），灭菌后加95%乙醇2滴。在无菌实验室内，将籼米研碎，取0.15 g左右于试管内，在28℃～34℃培养。

1.4.2 纯化方法

从长势均匀的培养管内，挑出红色菌体少许，分别置于黄豆芽培养基、发酵培养基和马铃薯培养基中，在28℃～34℃培养、观察。待红色菌体长出后，再将纯化后的红色菌体挑取少许置于灭菌生理水中，摇动至均匀。

1.4.3 培养

将纯化后的红曲霉菌种用接种环接种到灭菌后的麦芽汁琼脂斜面培养基上，在30℃～34℃培养48 h，然后挑取成熟、稳定的红色菌体置于无菌生理盐水中，摇匀。将少量悬液滴到麦芽汁琼脂培养基上。观察红曲霉孢子和菌落的产生情况。

1.4.4 平板分离筛选

以无菌水刮洗斜面菌种的孢子，将其注入带玻璃球的锥型瓶中，摇匀，得到孢子悬液。

1.4.5 梯度稀释孢子悬液

吸取1mL的孢子悬液注入9mL的无菌水中，即可得到10-1浓度倍数的孢子悬液。然后取10-1浓度倍数的孢子悬液1mL注入9mL无菌水中，即得10-2浓度倍数的孢子悬液。以此类推，可制得10-3、10-4浓度倍数的孢子悬液。

吸取原液10-1、10-2、10-3、10-4浓度倍数悬液各0.15mL注入平板，以无菌涂棒涂布均匀，编号。送入培养箱中在28℃下培养7 d。

根据单个菌落的颜色及长势状态，挑取8个接种至斜面上培养，送入培养箱中，在30℃下培养7 d。

将斜面培养的8个单个菌落分别接种至三角瓶中，在摇床上（温度28.5℃，转速200 r/min）培养，4 d后下摇床，分别测每瓶发酵液OD值，转换成色价。

2 结果与讨论

2.1 形态特征

将菌株在查氏酵母琼脂上27℃培养，5 d后，菌落的直径达21mm，表面呈毛状，边缘呈流苏状，菌落的颜色从中间开始由白色向粉红色慢慢转变，但由于菌丝在继续生长，周边的颜色仍为白色，可以看出此菌株已经开始向培养基分泌色素物质。

2.2 显微镜观察

在显微镜下，菌丝直径2μm～6μm，分枝状且具有横隔，呈椭球形，里面含有密集的孢子，分生孢子一般着生在菌丝的顶端，呈犁形，基部平截，成熟后为圆形。2.3平板分离出八株菌种产的色素情况

通过测色价可知其产色素的水平。实验结果如表1。

表1 平板分离菌株产色素结果统计表Table1 Flat panel separation strain producing pigment statistics result

2.4 应用结果

实验结果表明，在其他条件相同，不同的红曲霉菌株产色素的水平不同。以上的八株菌种中编号为018和156二株的产色素的水平较高，且发酵周期与豆瓣酱相同，因此可作为红曲霉豆瓣酱发酵罐实验的菌种。

3 结论

用3种选择分离培养基分离到产红色素霉菌菌株，通过摇瓶发酵试验筛选出产红色素能力比较强的编号为018和156菌株，此2株菌在马铃薯培养基和黄豆芽培养基上差别不大。通过形态特征与显微镜观察，根据李钟庆等和郭红珍等[7]对红曲霉的有关描述，可以鉴定出编号为018和156的菌株为红曲霉菌株，尤其018菌株在黄豆芽培养基上生长良好，利于产色素，且周期与豆瓣酱制作周期相同，将其命名为LLMY-18。说明，该菌株具有良好的实际应用价值，可以在固体和液体培养基上培养，适宜应用于新型豆瓣酱的加工生产。

[1]Lin CF.Isolation and culture condition of Monascus sp.for the production of pigment in submerged culture[J].J Ferment Technol, 1973,51:407-414

[2]Pastrana L,P J Blanc,M O Santerre,et al.Production of red pigments by Monascusruber in synthetic media with a strictly controlled nitrogen source[J].Process Biochem,1995,30:333-341

[3]Chen M H,M R Johns.Effect of pH and nitrogen source on pigment production by Monascus purpureus[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1993,40:132-138

[4]逯慎杰,刘秀河．功能性红曲中功能成分的研究进展[J].调味副食品,2011(1):17-21

[5]张菲菲,周立平,嘉晓勤,等.红曲菌应用研究进展[J].酿酒科技, 2009(7):91-94

[6]赖建平,罗军,古卓鑫．红曲色素稳定性探讨[J]．广州大学学报, 1999,13(4):56-60

[7]郭红珍．山西老陈醋大曲红曲霉分离鉴定及生物学特性研究[D]．山西农业大学硕士论文,2004

Screening and Separating of Soy Sauce Koji Fermentation Strain Monascus sp.LLMY-18

LU Sheng-you，LIU Xiu-mei，MA Hong-fei，YANG Xiang-hua*，WANG Zhan-yong
（Liaoning Shihua University Chemical and Environmental Sciences，Fushun 113001，Liaoning，China）

From the wort medium indica rice strains using，through the flat filter and solid culture method，the screening separation was obtained，stable quality，high yield，cycle for Monascus strain LLMY-18.The strains in the fermentation cycle and fermentation conditions and bean sauce of the same，pigments production capacity greatly increased，which can be applied to the production of soy sauce.Preliminary results suggest that LLMY-18 is involved in the fermentation of Monascus，made of red bean paste with ruddy color，mellow taste，taste delicious etc.

monascus；screening；bean paste

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.024

2012-11-03

卢生有（1991—），男（汉），本科，从事生物发酵学习和研究工作。

*通信作者：杨翔华（1959—），男（汉），教授，博士，研究方向：微生物资源开发及发酵工程。