双酶法生产葡萄糖酸锌的新工艺

李秋红，阿纳斯，李曰强，尹玉建

（西王集团有限公司，山东滨州256209）

双酶法生产葡萄糖酸锌的新工艺

李秋红，阿纳斯*，李曰强，尹玉建

（西王集团有限公司，山东滨州256209）

介绍一种双酶法生产葡萄糖酸锌的新工艺。新工艺采用葡萄糖作为主要原料，葡萄糖氧化酶在过氧化氢酶的协同作用下将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时流加一定浓度的氧化锌悬液进行中和，最终生成葡萄糖酸锌。研究葡萄糖浓度、pH、温度、空气流量对葡萄糖酸锌合成工艺的影响，并对葡萄糖酸锌结晶的最适宜条件进行初步研究。通过本工艺生产的葡萄糖酸锌纯度可达99.6%，可用于食品、医药、饲料、化妆品等诸多领域。

葡萄糖；葡萄糖氧化酶；过氧化氢酶；新工艺

锌是微量元素的一种，具有促进生长发育，改善味觉的作用，是一种必需微量元素。锌缺乏时会出现生长与智力发育低于正常，味觉、嗅觉差，厌食[1]。缺锌时要及时补充，以前多采用硫酸锌补锌，但是硫酸锌对胃肠道刺激作用大，容易引起恶心呕吐等现象，因此，硫酸锌现在逐渐被葡萄糖酸锌所代替，葡萄糖酸锌是弱酸弱碱盐，对肠道刺激远比硫酸锌小，且进入肠道以后容易吸收，利用率高，1986年被列为150种有发展前途的药品之一，是目前抗缺锌症的首选药物[2]，在临床上有很大的应用。

葡萄糖酸锌不仅用于医药方面，还广泛应用于食品行业，如葡萄糖酸锌幼儿饮用水、葡萄糖酸锌奶饮料、葡萄糖酸锌果冻等，将葡萄糖酸锌添加到各种食品中制成保健食品，用食补代替药补。随着人们生活水平的提高，人们“有病治病，无病健身”的思想，这无疑为葡萄糖酸锌提供了更为广泛的市场。

另外，葡萄糖酸锌还可以添加在饲料中作为动物的补锌制剂，还可以添加在化妆品中预防和治疗由于缺锌引起的唑疮。

由于葡萄糖酸锌在各个领域的广泛应用，它的制备研究得到越来越多的关注。据文献[3-6]记载，葡萄糖酸锌的合成多以葡萄糖酸钙和浓硫酸为原料，制取葡萄糖酸，然后经过纯化和氧化锌发生复分解反应制取葡萄糖酸锌。这种工艺具有原料不易获取，操作危险，产品纯度低等缺陷。双酶法生产葡萄糖酸锌的新工艺可以分为两个主要工段，即葡萄糖酸锌的制备工段和葡萄糖酸锌的结晶工段。葡萄糖酸锌的制备工段，最重要的是酶促反应能够平稳快速地进行，实验中最直观的反映就是反应周期。新工艺通过研究葡萄糖初始浓度、温度、pH和通风量对酶促反应周期的影响，优化以上工艺条件，并通过研究结晶时葡萄糖酸锌溶液的干物浓度对结晶的影响和温度对结晶产率的影响，优化葡萄糖酸锌结晶浓度和结晶温度。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄糖氧化酶GC199、过氧化氢酶CA1000L：杰能科生物工程有限公司；结晶葡萄糖：口服级，山东西王糖业有限公司；氧化锌：分析纯，莱阳经济开发区精细化工厂。

1.2 仪器

FMG-10L不锈钢发酵罐：南京金昶电子；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；RE52CS-1旋转蒸发器：上海亚荣；B-260恒温水浴锅：上海亚荣；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯；JJ-1定时电动搅拌器：江苏中大仪器；DT-500电子天平：常熟市金羊天平仪器厂；BCD-551WSY双开门冰箱：青岛海尔。

1.3 方法原理

葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下氧化为葡萄糖酸，过程中产生过氧化氢，过氧化氢有很强的氧化性，对葡萄糖氧化酶有一定的毒害作用，过氧化氢酶的加入就是为了迅速分解过氧化氢，使过氧化氢分解为水和氧气，使得葡萄糖氧化酶继续作用，并可以补充部分的氧气，使得氧化反应得以继续进行。反应过程中向反应体系中缓慢加入一定浓度的氧化锌悬液，以维持体系正常的pH环境，保护酶的活性，并保证葡萄糖酸锌的最终生成。

1.4 方法

1.4.1 葡萄糖酸锌的制备

配制300 g/L的葡萄糖溶液6 000mL，置于不锈钢发酵罐中，设定酶反应温度为35℃，反应过程中流加100 g/L氧化锌的悬液，调节控制pH在6.0左右，先后加入过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。通入无菌空气，控制通气量为5 L/min，当反应液中还原糖浓度降为0时，结束反应。

将反应液升温至95℃灭酶，加入活性炭脱色，过滤得滤液，在真空度为0.095MPa条件下，60℃蒸发浓缩至干物浓度为30%（质量分数）停止。冰水浴冷却结晶。真空抽滤得葡萄糖酸锌晶体。所得晶体在80℃下，烘干4 h，得成品葡萄糖酸锌（实验流程见图1）。将母液真空浓缩至干物浓度为30%（质量分数）进行二次结晶，干燥后得葡萄糖酸锌。两次结晶的收率为98.5%，所得葡萄糖酸锌纯度为99.6%。

图1 实验流程Fig.1 Experiment process

1.4.2 葡萄糖初始浓度对酶促反应周期的影响

分别配制葡萄糖初始浓度为260、280、300、320、340、360、380、400 g/L的反应液，其他反应条件保持不变，按照1.4.1的过程充分反应，当反应液中葡萄糖浓度为0时反应结束，记录反应周期。

1.4.3 pH对酶促反应周期的影响

配制葡萄糖初始浓度为300 g/L，反应过程中流加100 g/L的氧化锌悬液控制反应体系的pH分别为3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，其他反应条件保持不变，按照1.4.1的过程充分反应，当反应液中葡萄糖浓度为0时反应结束，记录反应周期。

1.4.4 温度对酶促反应周期的影响

酶促反应温度分别控制为30、35、40、45、50、55℃，其他反应条件保持不变，按照1.4.1的过程充分反应，当反应液中葡萄糖浓度为0时反应结束，记录反应周期。

1.4.5 通气量对酶促反应周期的影响

控制通气量分别为2、3、4、4.5、5、6、7、8 L/min，其他反应条件保持不变，按照1.4.1的过程充分反应，当反应液中葡萄糖浓度为0时反应结束，记录反应周期。

1.4.6 葡萄糖酸锌浓度对结晶的影响

将经过酶促反应制得的葡萄糖酸锌滤液蒸发浓缩到干物浓度分别为20%、25%、30%、35%（质量分数）置于冰水浴中放置10 h，通过观察不同干物浓度下的葡萄糖酸锌浓缩液的结晶情况，优化葡萄糖酸锌浓缩液结晶时的浓度。

1.4.7 结晶温度对葡萄糖酸锌产率的影响

将酶促反应获得的反应液升温灭酶，加入活性炭脱色，过滤得滤液，60℃蒸发浓缩至干物浓度为30%（质量分数）停止。将浓缩液分别置于冰水浴中和室温条件下冷却结晶，称取所得到的葡萄糖酸锌成品的质量，并分别计算一次结晶产率。通过比较不同温度下葡萄糖酸锌的产率优化结晶温度。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖初始浓度对酶促反应周期的影响

葡萄糖初始浓度对酶促反应周期的影响见图2。

图2 葡萄糖初始浓度对反应周期的影响Fig.2 Effect of glucose initial concentration

由图2可知，当葡萄糖初始浓度低于300 g/L时，随着葡萄糖浓度的增加反应周期成直线性增加，此时溶氧足够，反应周期与底物浓度成正比，即葡萄糖浓度越高，反应周期越长；当葡萄糖初始浓度在300 g/L～340 g/L之间时，反应会有一个较为快速稳定的周期，此时的葡萄糖浓度和溶氧达到一种平衡，使得葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶能够充分发挥作用；当葡萄糖初始浓度超过340 g/L时，反应周期明显加长，这是因为葡萄糖浓度过高，反应体系溶氧降低，会降低葡萄糖氧化酶的活性，延缓反应的进行。但是，如果葡萄糖浓度低，设备的利用率不高，相应的会增加生产成本。因此，选择一个合适的葡萄糖浓度是十分必要的。生产上一般控制葡萄糖的初始浓度在300g/L～340g/L之间。

2.2 pH对酶促反应周期的影响

pH在酶促反应体系是一个重要的控制指标，合适的pH，不仅会促进反应产物的生成，还是葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶赖以存活和发挥促进作用的重要条件。因此，合适的pH选择至关重要。葡萄糖氧化酶[7]适宜的pH值范围为3.5～6.5，过氧化氢酶适宜的pH范围为4.0～8.0。结合葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶要求的适宜pH，通过实验，考察了pH在3～8范围内的反应周期的变化，结果如图3。

图3 pH对反应周期的影响Fig.3 Effect of pH

由图3可知，当pH小于4时，pH偏低，酶促反应基本不进行；pH大于6.5时，随pH的增加，体系环境越来越不适宜酶促反应的进行，反应周期会相应加长；当pH在5.5～6.5之间时反应能够平稳快速的进行。因此，pH控制在5.5～6.5之间比较合适。

2.3 温度对酶促反应周期的影响

温度对酶促反应周期的影响见图4。

图4 氧化反应温度对反应周期的影响Fig.4 Effect of reaction temperature

温度是反应体系又一个重要的控制指标，对酶的活性尤为重要。葡萄糖氧化酶的适用温度是30℃～60℃，过氧化氢酶的适用温度是30℃～65℃，最适宜温度为40℃。温度过低不利于激活酶的活性；温度过高，会增加能耗，增加生产成本。因此要综合考虑，选择一个适宜的反应温度，既要保证酶的活性，又要把能耗控制在最低。由图4不难发现，当温度控制在35℃左右时，反应能够较为快速的进行，反应周期最短，能耗也低，综合以上考虑，氧化反应的反应温度一般控制在35℃左右。

2.4 通气量对酶促反应周期的影响

体系的通气量和溶氧量息息相关，通气量低，溶氧不足，酶促反应受到抑制，反应周期大大延长；若通气量过大，氧气来不及溶解即被带出，同样会造成溶解氧不足，延缓酶促反应的进行。并且通气量过大，部分料液会被出气带出，造成罐容的减少，料液的损失，产物收率低。经过实验1.4.5得到通风量与反应周期的关系，如图5。

图5 通气量对反应周期的影响Fig.5 Effect of air rate

由图5可知，当通风量小于5 L/min时，溶氧不足，反应周期长；当通风量大于5 L/min时，周期有上升趋势；当通风量为5 L/min时，反应周期短，此时，供氧充足，氧化反应能保持一个平稳快速的速度进行。因此，通风量为5L/min是一个理想的通风量。

2.5 葡萄糖酸锌浓度对结晶的影响

将葡萄糖酸锌滤液分别浓缩至干物浓度为20%、25%、30%、35%（质量分数）等不同的浓度，冰水浴中放置10 h，使充分结晶，当葡萄糖酸锌浓度大于30%时，晶核可以较快的形成，晶体析出较快。结晶沉淀和固液比情况如图6所示。

图6 葡萄糖酸锌浓度对结晶的影响Fig.6 Effect of zinc gluconate concentration

当葡萄糖酸锌浓度为20%、25%、30%时，结晶颗粒较大，沉淀情况良好，固液能够很好的分离；当葡萄糖酸锌浓度为35%时，由于浓度过高，结晶3 h，葡萄糖酸锌来不及形成晶体便析出成膏状，造成“糊罐”现象，固液无法分离，达不到结晶目的。综合考虑结晶状况和设备的利用率，葡萄糖酸锌浓度为30%无疑是最佳选择。

2.6 结晶温度对葡萄糖酸锌产率的影响

按照实验1.4.7制得葡萄糖酸锌成品，称量计算，分别得出冰水浴条件下冷却结晶和室温条件下结晶葡萄糖酸锌成品的产率分别为87.23%和76.55%，温度越低葡萄糖酸锌的产率越高。这是因为温度越低葡萄糖酸锌在水中的的溶解度越小，葡萄糖酸锌越容易结晶析出，理论产率高低与实验结果相符。因此，葡萄糖酸锌结晶时，温度越低越好，结合生产实践，一般控制在0℃（冰水浴）。

2.7 产品质量分析

双酶法生产葡萄糖酸锌的新工艺采用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶直接将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，然后与氧化锌发生复分解反应制备葡萄糖酸锌。相比较于传统的生产工艺，该法既没有催化氧化法带来的重金属污染，也没有发酵法带来的蛋白质和辅料杂质的影响，产品纯度高，可以达到99.6%。对在优化后的实验条件下获得的葡萄糖酸锌精品进行产品质量分析，结果如表1所示，各项指标均达到食品添加剂葡萄糖酸锌（GB8820-2010）《食品添加剂葡萄糖酸锌》所要求的产品标准[8-9]，因此，按本工艺制备的葡萄糖酸锌产品完全可以作为食品添加剂使用。

表1 葡萄糖酸锌的质量指标分析结果Table1 Analysis results of the zinc gluconate

3 结论

1）经过一系列的优化实验，得出葡萄糖酸锌生产的最适宜条件为：葡萄糖初始浓度在300 g/L～340 g/L之间，氧化反应pH控制在5.5～6.5之间，氧化反应温度为35℃，通气量为5 L/min，结晶浓度为30%（质量分数），冷却结晶采取冰水浴。

2）新工艺生产的葡萄糖酸锌成品符合GB8820-2010的要求，完全达到食品添加剂的各项指标，可以应用于食品领域。

[1]刘薇芝,胡汉昆,刘萍,等.葡萄糖酸锌药理作用与临床应用[J].医药导报,2009,28(8):1060-1061

[2]高晓慧,罗洋.葡萄糖酸锌合成方法研究[J].黑龙江医药,1996,9 (2):92-93

[3]褚恩义,饶豫鄂.葡萄糖酸锌的研制[J].陕西化工,1992(2):23

[4]蒋金芝,唐有根,王要武,等.葡萄糖酸锌的研制[J].精细化工, 1996,13(6):39-41

[5]解从霞.葡萄糖酸锌合成新工艺[J].大连轻工业学院学报,1997, 16(3):84-87

[6]王芳斌.葡萄糖酸锌合成的新方法和结构分析[J].常德师范学院学报,1999,11(3):60-61

[7]周红伟,姜锡瑞,段钢.酶法生产葡萄糖酸钙的新工艺[J].食品与发酵工业,2007,33(7):99-101

[8]国家医药管理局.GB8820-1988食品添加剂葡萄糖酸锌[S].北京:国家医药管理局,1988:1

[9]国家医药管理局.GB8820-2010食品添加剂葡萄糖酸锌[S].北京:国家医药管理局,2010:1

A Novel Enzymatic Process for Zinc Gluconate Production

LI Qiu-hong，ANAS*，LI Yue-qiang，YIN Yu-jian
（Xiwang Group Company Limited，Binzhou 256209，Shandong，China）

A new production method for zinc gluconate production is introduced in this article.According to this method，selected enzyme of Glucose oxidase catalyzes the oxidation of glucose，as substrate，to gluconic acid in the presence of oxygen supply with simultaneous production of hydrogen peroxide（H2O2）while gluconic acid is neutralized by zinc oxide to produce zinc gluconate.The present paper studies the influences of following parameters such as glucose concentration，pH，temperature，air flow rate，and optimum crystallization conditions on zinc gluconate processing.The purity of the zinc gluconate can reach up to99.6%.Zinc gluconate produced using enzymatic method can be used in the area of food，pharmaceutical，feed，cosmetic industries，etc.

glucose；glucose oxidase；catalase；novel process

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.004

2012-09-26

李秋红（1982—），女（汉），助理工程师，本科，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：阿纳斯（1964—），男，中级工程师，博士，研究方向：玉米深加工。