弓形虫复合基因疫苗研究进展

赵 盛，张奇雪，张保德，王圆圆，苑文英

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

弓形虫复合基因疫苗研究进展

赵 盛，张奇雪，张保德，王圆圆，苑文英

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

弓形虫疫苗包括全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗，现阶段研究较多的是后两种，由原来的单一疫苗向复合疫苗发展，复合疫苗有多种联合方式：表面抗原联合、表面抗原与分泌抗原联合、其他类型抗原联合，疫苗免疫效力低下的缺点可采用有效免疫方式或使用佐剂提高效果。

弓形虫；基因；疫苗

弓形虫疫苗研制发展经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗4个阶段。全虫疫苗包括死疫苗和活疫苗；虫体特异组分疫苗是除去无保护作用甚至有害的成分，保留其有效的免疫原成分制成的疫苗；DNA疫苗是裸露DNA注入机体内而产生免疫力；基因工程疫苗是利用DNA重组技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化制得的疫苗，应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗，动物试验和人体观察发现，单基因疫苗免疫效果不理想，通过抗原组合制成复合基因疫苗可以弥补不足，是现今研究的一个发展方向。

弓形虫生活史比较复杂，抗原成分有发育期特异性，可以分为以下几种：速殖子表面抗原（SAG）、细胞器分泌抗原如致密颗粒蛋白（GRA）、棒状体蛋白（ROP）、微线体蛋白（MIC）以及非表面或分泌抗原如热休克蛋白70（HSP70）、肌动蛋白（TgACT）等，不同抗原具有特异性，把生活史不同阶段多个特异组分抗原联合，制成复合基因疫苗，产生免疫保护作用。多基因疫苗的良好效果为构建理想疫苗奠定了理论和实验基础。

1 表面抗原联合的复合疫苗

弓形虫表面抗原（SAG）主要是速殖子期表达，主要的5种分别是：P30，P22，P35，P23，P43。

P30（SAG1）抗原因其特异性强、所占比例大，具高度的免疫原性和免疫保护性，是诊断和疫苗开发的主要候选抗原，也是研究最多、应用前景最广泛的抗弓形虫基因疫苗。尽管SAG1可刺激机体产生IgG、IgM、IgA抗体以及细胞因子IFN-γ[1]等杀死虫体，具有较好的免疫原性和免疫保护性，但实验表明，速殖子期特异性蛋白只能产生部分保护性[2]，P22（SAG2）在弓形虫入侵宿主过程中发挥重要作用。孙怡等[3]构建了P30-P22复合基因疫苗免疫小鼠，可以诱导一定的体液免疫和细胞免疫，效果远远超过P30、P22单基因疫苗，乔增培[4]对表膜蛋白SAG5B免疫保护性研究，证明rSAG5B以及rSAG1均对小鼠有免疫保护作用，但这些抗原基因大多只能在弓形虫速殖子期表达，其他时段不表达，故只能对速殖子期起到免疫保护作用，针对生活史某个阶段的基因疫苗常常不能对其他阶段提供很好的免疫保护性。

2 表面抗原与细胞器分泌抗原联合的复合疫苗

鉴于表面抗原联合的不足，人们开始对弓形虫生活史其他期表达的细胞器分泌抗原如棒状体蛋白（ROP）、致密颗粒（GRA）以及微线体蛋白（MIC）进行了研究，研制出在虫体不同生长期均有良好免疫效果的疫苗，研究发现以速殖子期和其他抗原组合的复合基因疫苗效果好。

2.1 表面抗原与棒状体蛋白（ROP）联合的复合疫苗

棒状体蛋白18（ROP18）在虫体入侵和纳虫空泡的形成和修饰过程中起重要作用，是弓形虫入侵和功能性毒力决定性作用因子[5]，可以改变受感染宿主细胞信号传导，阻止细胞凋亡，改变基因表达，介导病理损伤。当弓形虫进入宿主细胞时，会生成一层保护膜包裹自身，使自己虽受细胞环境影响而不被杀死，ROP18的作用则是让宿主细胞某些蛋白失效而无法破坏这层保护膜。许越等[6]构建了ROP18基因原核表达质粒，证明具有一定的抗再感染保护作用。棒状体蛋白2（ROP2）在生活史的速殖子、缓殖子、子孢子期均能表达，主要协助虫体入侵宿主细胞[7]，能充分刺激机体的免疫系统引发保护性反应，具有高度的保守性和免疫原性，ROP2疫苗单独不能诱导出敏感小鼠保护性[8]；而每鼠25μg的低剂量SAG1与ROP2混合基因疫苗[9]却能使小鼠抵御RH株弓形虫致死性攻击感染，SAG1或ROP2单基因低（每鼠25μg）、高（每鼠50μg）剂量组小鼠均在8 d内死亡，表明此种双基因联合能够增强DNA疫苗的免疫效果。杨婷婷[10]用构建的SAG1-ROP2复合基因疫苗证实，通过激活机体CD8+T细胞以及Thl型细胞免疫和分泌特异性抗虫抗体发挥抗感染作用，各项免疫指标均优于单基因疫苗免疫组[11]。由此认为，SAG1作为速殖子期主要抗原和在弓形虫生活史的三个阶段均有表达的ROP2组成的复合基因疫苗具有更强的免疫保护性，具有巨大的潜力。

2.2 表面抗原与致密颗粒蛋白（GRA）联合的复合疫苗

致密颗粒蛋白2（GRA2）具有很强的抗原性，可作为弓形虫感染的诊断抗原和疫苗成分，高洋等[12]构建SAGl、GRA4单基因疫苗及SAGl-GRA4复合基因疫苗，对比试验表明，复合基因疫苗具有更好的免疫保护性。孙玲[13]对复合基因疫苗GRA1/MIC6的免疫研究证明，比GRA1、MIC6基因疫苗有更好的免疫保护作用，由此推测复合基因疫苗所包含的抗原类型越多、组分越复杂，免疫范围越宽广、效果越强大。

2.3 表面抗原与微线体蛋白（MIC）联合的复合疫苗

MIC是微线体分泌的，属于小血管反应蛋白相关匿名蛋白家族，是虫体入侵宿主细胞必需因子，在虫体识别、移动、粘附入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用。弓形虫MIC8在速殖子和裂殖子中均可表达，当MIC8基因被敲除后虫体不能连接到宿主细胞而无法完成入侵过程[14]。Liu等[15]报道，小鼠肌注MIC8能预防弓形虫感染，在疫苗研究中具有潜在应用价值。姚远等[16]成功将SAG1和MIC8两个基因构建在同一个表达载体pcDNA3.1上，肌注免疫C57BL/6J小鼠，用ELISA法分别检测各组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c水平，发现pcDNA3.1 SAG1-MIC8组初次免疫后，血清中IgG，末次血清中IgG2b、IgG2c均显著高于其他各组，再感染后的生存时间也最长，由此认为SAG1-MIC8复合基因疫苗的免疫效果优于SAG1和MIC8单基因疫苗，同样ROP18-MIC2复合基因疫苗的免疫效果亦优于ROP18和MIC2单基因疫苗[17]。

3 其他类型抗原组合构建的复合基因疫苗

弓形虫其它抗原有：非表面或分泌抗原如热休克蛋白70（HSP70）、肌动蛋白（TgACT）等，HSP70是高度保守的非特异性细胞保护应激蛋白，主要是加工提呈抗原，也是目前发现的主要分子伴侣蛋白之一。肖婷等[18]成功构建了SAG1-ROP2-HSP70复合基因的真核表达质粒pc-DNA3-SAG1-ROP2-HSP70，疫苗的免疫保护性研究尚在进行中。郝海霞[19]对弓形虫肌动蛋白基因进行研究：证实rTgACT具有抗原性，不同剂量免疫小鼠均有保护作用，30μg滴鼻免疫能更有效诱导黏膜和系统免疫应答。Daryani 等[20]实验发现，用ESA和STAg免疫小鼠，可诱导黏膜及系统的细胞和体液免疫应答，产生较强的免疫效果。石娜[21]建立AMA1-ROP18联合疫苗，并与单抗原疫苗免疫效果对比，发现虽然三种抗原疫苗均能有效保护小鼠抵抗感染，但联合疫苗效果最佳。陈琳[22]构建了双基因疫苗pBud CE4.1-ROP18-MIC2，肌注免疫BALB/C小鼠，观察到可产生细胞和体液免疫，各项指标以及抗致死性感染生存率均显著优于任何一种单基因疫苗。马广源[23]研究发现，9种具有免疫原性的非表面或分泌抗原，分别是蛋白质二硫键异构酶、冠蛋白、热休克蛋白60、丙酮酸激酶、谷氨酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、尿苷磷酸化酶、过氧化氧化还原蛋白、蛋白激酶c受体1。任意两种以上抗原组合构建的复合基因疫苗，都可以成为研制的新方向。

4 基因疫苗的不足及应对方法

核酸疫苗具有免疫效力低下的缺点，可以采用不同免疫方式或使用佐剂提高效果，不同免疫方式有经口、滴鼻、肌肉或皮下注射等；佐剂如毒素、核酸、细胞因子、免疫协同刺激因子、补体分子、脂质体、聚合物等。

4.1 采用不同免疫途径对免疫效果的影响

通常经口[24]是弓形虫的主要感染方式，进入人体后随循环系统经肠黏膜上皮细胞扩散至全身致病，抗弓形虫感染首道防线就是肠道黏膜屏障。口服和滴鼻是诱导黏膜保护性免疫的主要途径，以滴鼻效果好，原因是经口抗原易被消化、降解[25]，产生sIgA量少，而鼻内免疫，只需较少的抗原就能诱导有效免疫应答。焦玉萌等[26]观察弓形虫可溶性速殖子抗原（STAg）经滴鼻、灌胃和皮下注射3种途径免疫小鼠诱导免疫应答：20 pg滴鼻诱导的黏膜免疫优于灌胃和皮下注射；皮下注射免疫血清IgG抗体水平高于滴鼻和灌胃，但其未能诱导黏膜免疫应答。Saadatnia 等[27]用弓形虫感染后不同时间提取的腹水ESA鼻内免疫小鼠，48 h诱导的黏膜及系统免疫应答效果最好。所以选用合适剂量、时间、途径能够达到更好的免疫效果。

4.2 应用免疫佐剂提高免疫效果

霍乱毒素是目前常用的免疫佐剂，能有效增强抗原的免疫原性和免疫保护，CT2A/B有效诱导Th2型（IgG，sIgA）和激活黏膜免疫。李婷[28]设计并合成一段含三对免疫刺激序列的核苷酸，构建质粒pcDNA3.1/CpG- SAG-ROP2，肌注小鼠，证实以细胞免疫为主，增加CpG优于SAG-ROP2组，CpG可增强免疫效应。赵红等[29]用SAGl-ROP2、大肠埃希菌肠毒素B亚基，经肌内免疫BALB/C小鼠，结果IgG抗体水平明显提高，NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性明显增强，小鼠抗攻击感染生存时间延长，说明该复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有所提高。陈兴智等[30]选用三种免疫调节剂作为佐剂，增强弓形虫重组ROP2疫苗保护效应。

[1] 朱思梅, 周亚萍, 朱荫昌, 等. 弓形虫表面抗原SAG1的可溶性表达及其免疫学活性分析[J]. 中国病原生物学杂志, 2011, 6(11): 816-818, 812.

[2] 聂福旭, 蒋蔚, 王权, 等. 弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析[J]. 生物技术通报, 2010, 1(4): 173-178.

[3] 孙怡, 何深一. 弓形虫P30-P22复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答[J]. 临沂医学专科学校学报, 2004, 26(6): 401-403.

[4] 乔增培. 弓形虫SAG5B和SAG1基因的克隆表达及其对小鼠免疫保护性研究[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2008.

[5] BEHNKE M S, KHAN A, WOOTTON J C, et al. Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(23): 9631-9636.

[6] 许越, 张莹光, 徐丹, 等. 弓形虫棒状体蛋白ROP18的原核表达及其免疫保护性研究[J]. 中国病原生物学杂志, 2013, 8(8): 708-711.

[7] 陈晨, 公茂庆, 寇景轩. 可溶性弓形虫棒状体分泌蛋白2(ROP2)的免疫原性和抗弓形虫感染核酸疫苗的研究[J]. 中国保健营养, 2013, 03(上): 1031.

[8] 陈兴智, 杨小迪, 杨雯, 等. 西咪替丁伍用弓形虫ROP2蛋白免疫小鼠诱导免疫反应的初步研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2013, 31(2): 99-103.

[9] 韩欣悦. 弓形虫高反应原性抗原的筛选及其初步应用[D]. 长春: 吉林大学, 2012.

[10] 杨婷婷. 弓形虫P30单基因疫苗与P30-ROP2复合基因疫苗免疫小鼠的实验研究[D]. 济南: 山东大学, 2005.

[11] 李文姝, 谢自新, 陈庆新, 等. 弓形虫ROP2-SAG1重组复合蛋白及其重组质粒的免疫效应[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2010, 28(5): 359-363.

[12] 高洋, 程子英, 王铭, 等. 弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建[J]. 中国预防兽医学报, 2013, 35(11): 886-890.

[13] 孙玲. 弓形虫GRA1/MIC6双价核酸疫苗及亚单位疫苗的研究[D]. 长春: 吉林大学, 2012.

[14] 赵焕阁, 谭光宏, 黄凤迎, 等. 弓形虫MIC8基因对弓形虫病的免疫保护性研究[J]. 热带医学杂志, 2011, 11(11): 1253-1254, 1275.

[15] LIU M M, YUAN Z G, PENG G H, et al. Toxoplasma gondii microneme protein 8(MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis[J]. Parasitol Res, 2010, 106(5): 1079-1084.

[16] 姚远, 何深一, 王花欣, 等. SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2010, 28(2): 81-88.

[17] 陈琳, 何深一. 石娜, 等. 弓形虫ROP18-MIC2重组真核质粒的构建与表达[J]. 山东大学学报: 医学版, 2012, 50(8): 62-67.

[18] 肖婷, 魏庆宽, 李瑾, 等. 弓形虫 pcDNA3-ROP2-p30-HSP70复合基因真核表达重组质粒的构建[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2010, 22(4): 329-332.

[19] 郝海霞. 刚地弓形虫肌动蛋白基因的克隆、表达及重组蛋白的保护性免疫[D]. 太原: 山西医科大学, 2012.

[20] DARYANI A, SHARIF M, KALANI H, et al. Electrophoretic patterns of Toxoplasma gondii excreted/secreted antigens and their role in induction of the humoral immune response[J]. Jundishapur J Microbiol, 2014, 7(4): 1-8

[21] 石娜. 弓形虫基因疫苗pBudCE4. 1-AMA1-ROP18免疫小鼠的保护作用研究[D]. 济南: 山东大学, 2012.

[22] 陈琳. 弓形虫ROP18-MIC2双基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究[D]. 济南: 山东大学, 2012.

[23] 马广源. 弓形虫可溶性速殖子抗原的免疫原性蛋白质组学分析[D]. 太原: 山西医科大学, 2008.

[24] TAPPEH K H, KHORSHIDVAND Z, SHAHABI S, et al. A novel adjuvant, mixture of Alum and naltrexone, elicits humoral immune responses for excreted/secreted antigens of Toxoplasma gondii tachyzoites vaccine in Balb/c murine model[J]. Turkiye Parazitol Derg, 2013, 37(2): 92-96.

[25] MATTOS C C, MEIRA C S, FERREIRA A I, et al. Contribution of laboratory methods in diagnosing clinically suspected ocular toxoplasmosis in Brazilian patients[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, 70(3): 362-366.

[26] 焦玉萌, 章黎, 葛以跃, 等. 弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞的影响[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2011, 23(3): 301-306.

[27] SAADATNIA G, GHAFFARIFAR F, KHALILPOUR A, et al. A Toxoplasma gondii 10 kDa in vitro excretory secretory antigen reactive with human IgM and IgA antibodies[J]. Trop Biomed, 2011, 28(3): 606-614.

[28] 李婷. CpG免疫刺激序列增强弓形虫速殖子复合基因疫苗免疫保护作用的研究[D]. 济南: 山东大学, 2010.

[29] 赵红, 何深一, 李婷, 等. 大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2010, 28(2): 115-119.

[30] 陈兴智, 杨小迪, 杨雯, 等. 三种免疫调节剂增强弓形虫重组ROP2疫苗保护效应的研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2013, 29(6): 570-574.

（责任编辑：刘俊华）

Advance on gene vaccine reseach of Toxoplasma gondii

ZHAO Sheng, ZHANG Qixue, ZHANG Baode, WANG Yuanyuan, YUAN Wenying
(College of Basic Medical Science, Hebei University, Baoding 071000, China)

Toxoplasma gondii; gene; vaccine

R382.2

A

1674-490X(2014)06-0080-05

2014-08-09

河北省科技厅基金项目（112761122）；河北省医学科学研究重点课题计划（ZL20140224）；保定市科学技术研究与发展指导计划（13ZF086）

赵盛（1977—），男，河北保定人，讲师，主要从事病原生物学及免疫学研究。E-mail: 1285714719@qq.com

苑文英（1965—），女，河北满城人，教授，主要从事病原生物学及免疫学研究。E-mail: yuanwy7830@sina.com

Absract: Toxoplasma gondii vaccine include whole organism vaccine, ingredient vaccine, DNA vaccine, genetic engineering vaccine, The more researches about these were the last two, development from single vaccine to complex gene vaccine, complex gene vaccine has many modes: union between SAGs, ingredient vaccine, DNA vaccine, genetic engineering vaccine, union of SAG and secret antigen, union of other antigen, the shortcomings of the lower immunity about gene vaccine can be improved with effective immunity method or adjuvant.