肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展*

林华胜 张薇 李国明

肺炎克雷伯菌（KPN）是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。近年来，由于临床上抗菌药物的大量应用和滥用，致使KPN耐药率居高不下，直接影响到临床治疗效果。Amazian等[1]研究显示，肺炎克雷伯菌占地中海地区医院内感染的9.2%；2011年全国医院感染监控网医院感染病原菌分布调查显示KPN占9.03%，成为国内医院感染的第二大病原菌[2]。国外曾经报道一组由多重耐药KPN引起医院内感染的暴发流行，死亡率高达40%[3]。KPN主要耐药机制包括产生抗菌药物灭活酶、药物作用靶位的改变、抗菌药物渗透障碍（生物被膜、外膜孔蛋白缺失）、主动外排泵系统的亢进作用等，同时抗菌药物耐药基因借助质粒、转座子、整合子的播散也是耐药菌株临床加剧的重要原因。本文对上述耐药机制的研究进展作一简要综述。

1 产生抗菌药物灭活酶

细菌可产生许多能引起抗菌药物灭活的酶，主要包括β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶（AME）。KPN对β-内酰胺类药物耐药的主要机制之一是产生β-内酰胺酶。它可通过水解β-内酰胺环，使β-内酰胺类药物水解从而失去抗菌活性，其水解率是细菌耐药性的主要决定因素。KPN产生的β-内酰胺酶主要包括产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、质粒介导的AmpC酶、耐酶抑制剂的β-内酰胺酶（IRBLs）及碳青霉烯酶（KPC酶）等。

1.1 产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是KPN耐药产生的最主要的一类酶。1983年由德国报告了世界上第一例ESBLs，1994年在中国医学科学院北京协和医院发现国内首例ESBLs感染，迄今已报告的ESBLs的代表菌株有肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌等。ESBLs是由质粒介导的丝氨酸蛋白衍生物，通过水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素及单环β-内酰胺类药物的β-内酰胺酶，导致此类抗菌药物耐药，可被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸钾所抑制，但罗燕萍等[4]报道，产ESBLs的PKN对酶抑制剂复合抗生素也有较高的耐药率。

ESBLs以TEM型和SHV型最常见，CTX-M型是我国的主要基因型。TEM型ESBLs主要对青霉素、氨苄西林及头孢他啶等一代头孢菌素耐药，但对头孢噻肟敏感，对舒巴坦和克拉维酸耐药是所有CTX-M型酶的特点。SHV型ESBLs由质粒介导或染色体编码产生，主要引起细菌对第一代头孢菌素和青霉素耐药，SHV-1型对阿莫西林、氨苄西林等青霉素类抗菌药物有较强的水解作用。目前用于治疗产ESBLs菌所致感染的药物有碳青霉烯类、头霉素类抗生素，亚胺培南具有超广谱、高效的抗菌活性，是治疗ESBLs菌感染的首选药物。

1.2 质粒介导的AmpC酶 AmpC酶由AmpC基因编码产生，AmpC基因表达同时受AmpD、AmpR、AmpG等多种基因的调控。质粒介导的AmpC酶是由位于肠杆菌属、假单胞菌属及沙雷菌属等菌属染色体上的AmpC基因通过基因转移方式转到KPN的质粒上，伴随细菌复制而编码产生，其容易引起KPN或大肠埃希菌对第三代头孢菌素或酶抑制剂的耐药[5]。自1988年发现首例质粒介导的AmpC酶MRI-1，迄今已有40余种基因型，世界范围内以CMY-2型多见，国内主要为DHA-1型和ACT-1型，多在克雷伯菌、大肠埃希菌和沙门菌等菌属中呈持续高表达状态传播。近年还发现AmpC酶不仅由染色体介导，也可由质粒介导，且质粒介导者因其具有较快的传播速度和较强的耐药性，导致耐药性的广泛传播，这都成为临床抗感染治疗较棘手的问题[6]。

质粒介导的AmpC酶与ESBLs的区别在于前者能水解第3代头孢菌素类、单环内酰类和头霉素类（附ACC1外），而且不受酶抑制剂的抑制作用，对类碳青霉烯类药物或第4代头孢菌素敏感。但Wang等[7]研究发现，缺失一种39×103大小的外膜蛋白的产DHA-1的KPN对碳青霉烯类药物的敏感性出现不同程度的降低。Bidet等[8]研究发现，产ACC1的KPN在缺失一种36×103大小的外膜蛋白后，对亚胺培南产生了耐药性。

1.3 耐酶抑制剂的β-内酰胺酶（IRBLs）IRBLs是一种不受酶抑制剂所抑制的β-内酰胺酶，属于Ambler分子分类的A类、Bush功能分类的2br亚类，TEM型是主要来源，由TEM-1、TEM-2、SHV-1基因发生突变形成，其他还有SHV-10、SHV-49、OXY-2以及OXA型的β-内酰胺酶等。KPN对酶抑制剂的主要耐药机制是由质粒介导β-内酰胺酶基因特别是TEM-1基因发生突变后，产生了TEM型β-内酰胺酶而引起对酶抑制剂耐药。其特点容易导致KPN对阿莫西林、替卡西林及其酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦及其复合抗生素耐药，但对窄谱头孢菌素、7-α-甲氧基头孢菌素和氧亚氨基头孢菌素敏感。

1.4 碳青霉烯酶（KPC酶）KPN对碳青霉烯类最主要的耐药机制的是产生KPC酶，它能水解包含碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素，而且绝大多数对β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。这些酶以产KPC酶为主，主要由质粒介导，包括Ambler分类的A、D类KPC酶和B类金属β-内酰胺酶。KPN容易引起碳青霉烯类、广谱头孢菌素类、青霉素类或单环类抗菌药物产生耐药。

KPC酶最早由Yigit等[9]于2001年在美国北卡罗来纳州的KPN中发现，属于KPC-1型；国内于2006年首次报道在一株KPN中检测到KPC-2。至今已发现的KPC酶有KPC-1~11共11种类型，其中以KPC-2和KPC-3在临床分离菌株中最为常见，且是引起大多数爆发流行的主要类型[10]。2005年和2011年在美国先后发生了碳青霉烯类抗生素耐药的KPN流行[11-12]。我国2010年CHINET耐药监测数据表明，KPN对碳青霉烯类的耐药率为10%，由此可见KPC酶介导的耐药将成为KPN耐药的重要机制之一[13]。

另外，KPN也会产生氨基糖苷类钝化酶（AME），这是引起细菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药的主要机制。

2 药物作用靶位的改变

在KPN中，编码拓扑异构酶Ⅳ的parC基因及编码DNA旋转酶的gyrA基因靶位出现变异时，这两类酶的结构构象容易发生变化，致使酶-DNA复合物与抗菌药物不能稳定结合，达不到干扰细菌DNA合成的作用，最终引起KPN对喹诺酮类耐药。gyrA基因变异在基因靶位的变异中起主导作用，位于gyrA的丝氨酸Ser83和天冬氨酸Asp87，丝氨酸Ser80和parC的谷氨酸Glu84是最常见变异位点。高山等[14]研究应证了第83位氨基酸的改变是喹诺酮类耐药的主要原因。

质粒介导的耐药基因qnr是另一种耐药机制，其通过编码蛋白与拓扑异构酶Ⅳ进行特异性结合，减少喹诺酮类药物的作用靶位从而产生细菌耐药。李娟等[15]报道，在37株KPN中检测到有7株携带qnrS基因，且全部具有多重耐药性，只有对亚胺培南敏感。

3 抗菌药物渗透障碍

3.1 生物被膜（BF）BF是细菌吸附在机体腔道黏膜表面，通过分泌多糖蛋白复合物包绕而形成的膜状物。BF可通过物理阻挡作用阻止外来大分子物质的渗入，同时与抗菌药物结合制约其进入到细菌生物被膜内部，最终导致细菌接触到的抗菌药物浓度过低产生耐药。Anderl等[16]通过用10倍MIC浓度的氨苄西林对抗浮游生长和生物被膜状态的KPN，证明BF可以阻止药物渗入而使氨苄西林产生耐药性。Yang等[7]还发现BF菌的特殊结构和生理特性使菌体内抗菌药物浓度明显降低，有更多机会诱导浮游生长菌产生β-内酰胺酶而引起耐药。

3.2 外膜孔蛋白缺失 KPN等革兰阴性菌细胞外膜脂多层中存在由许多微孔蛋白组成的孔道，它是一种非特导性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道，一些β-内酰胺酶类药物可经通道进入菌体内而发挥作用。若微孔蛋白发生改变或缺失，抗菌药物将难以渗入细菌胞内而出现耐药。氨基糖苷类等抗菌药物因尚有其他通道进入，故影响不大。

KPN的孔蛋白最常见发生耐药是OmPK35，其他还有OmPK36、OmPK37等。孔蛋白的改变增加细菌耐药性，与灭活酶并存时的耐药程度比灭活酶单独作用时高。Webster等[18]报道，OmpK35和OmpK36的缺失可导致KPN对美罗培南耐药。

4 主动外排泵系统的亢进作用

在KPN的内膜上存在能量依赖性蛋白外排泵的外排系统，能主动将渗入细菌体内的的药物不断泵出。当细菌体内某种调节机制发生改变，导致主动外排系统表达亢进，使菌体内的药物浓度不足以发挥抗菌作用而导致耐药。这是KPN产生多重耐药的重要机制之一。由于这种系统是非专一性的，广泛包括内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类等抗菌药物在内的外排底物，往往多种主动外排系统并存于同一株细菌，因此可导致细菌对各种完全不同结构的抗菌药物的产生耐药。马建新等[19]和彭少华等[20]研究发现，多药耐药KPN抗菌制剂外排泵基因携带率较高。

5 整合子

整合子是由Hall于1989年首次发现提出的概念。它是一种能被识别和俘获的外源性可移动基因，其位于细菌的质粒或染色体上，是携带编码抗菌药物耐药基因盒的DNA片断，它具有位点特异性的基因重组系统。研究表明，整合子不仅能通过介导细菌耐药性群聚而产生多重耐药性，而且可在菌种和不同遗传物质间转移，引起耐药基因快速广泛播散[21]。整合子作为遗传的基因元件普遍存在革兰阴性菌中，根据整合酶基因同源性主要分4类，与细菌耐药性密切相关主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子。其中Ⅰ类整合子在临床分离菌株中分布最广泛，由 5′ 保守区（5′ CS）、3′ 保守区（3′ CS）和两者之间的可变区3个部分组成，其携带的耐药基因盒包括对氨基糖苷类、磺胺、喹喏酮类和消毒剂等130多种，其编码产物可赋予细菌对全部临床常用药物种类产生耐药，因此Ⅰ类整合子是目前整合子研究的热点。研究表明，细菌1个整合子同时能够捕获多个基因盒表达出对不同抗菌药物的多药耐药性，而整合子内部包含某些ESBLs编码基因更易促使携带整合子的产ESBLs菌株表达出扩散优势。研究证明，在产ESBLs的KPN中已经相当普遍存在Ⅰ类整合子[22-23]。Ⅱ类整合子在细菌中分布比较为局限，主要分布在志贺菌属中，大肠埃希菌、变形菌属、沙门菌属等也曾发现。李涛等[24]从98株KPN中检出携带Ⅱ类整合酶基因的阳性率仅为1%，提示KPN中Ⅱ类整合子的携带率较低。Ⅲ类整合子至今检出极少。

6 结语

综上所述，由于微生物等对药物耐药性的广泛出现，使抗感染治疗重新成为一个棘手的问题。KPN作为一种条件致病菌所引起的感染在细菌感染性疾病中的比重日渐增加，其耐药机制非常复杂多变，抗菌药物对其产生的耐药性日趋严重，许多领域仍亟待更深一步的探索研究。在临床治疗中，医务工作者要逐步掌握细菌的耐药特性，研制并合理、有效使用抗生素，提高抗感染的成功率。

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