禽脑脊髓炎病毒YL株的分离鉴定

郝华芳，张淑霞，杨 涛，杨增岐，王兴龙，杜恩岐，党如意，王晶钰

（西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌712100）

禽脑脊髓炎（AE）是由禽脑脊髓炎病毒（Avain Encephalomyelitis Virus，AEV）引起的一种主要侵害幼龄鸡的病毒性传染病。以共济失调、头颈部快速震颤、衰竭死亡、产蛋下降为特征。本病1930年最早发现于美国，我国于1980年首次被张泽纪报道，随后在我国迅速传开[1]。陕西省自1997年报道AE以来，近年来疫情有上升的趋势[2]。2012年1月，陕西杨凌某种鸡场，种鸡产蛋量突然下降约26%，种蛋孵化率降低20%左右，死雏、弱雏明显增多，剖检可见腺胃壁表面有少量灰白色病灶，脑组织有轻微水肿、充血，初步怀疑为禽脑脊髓炎，通过采集病料、接种SPF鸡胚进行病毒分离与鉴定，结果分离到1株AEV陕西地方流行毒株，并对该分离株的VP1基因进行了序列分析，试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 抗原及血清 标准AE琼扩抗原、AE阳性血清、SPF鸡血清由西北农林科技大学动物医学院禽病研究室提供。

1.2 SPF鸡胚 1日龄非免疫鸡、6日龄SPF鸡胚，购自杨凌绿方生物工程公司。

1.3 分子生物学试剂 RNAiaso Plus、pMD18-T Simple载体、反转录试剂盒、DNA标准DL-2 000、PCR Taq酶、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ，购自宝生物工程（大连）有限公司；高纯度质粒提取试剂盒，购自威格拉斯生物技术有限公司；胶回收试剂盒，购自西安润德有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.4 病毒分离鉴定 无菌采集病鸡的大脑和十二指肠，研磨冻融后，4 000 r/min离心5min，取上清加双抗10 000 IU（μg）/mL，4℃作用6 h后接种6日龄SPF鸡胚的卵黄囊，0.2mL/枚，置37℃温箱培养，每天照蛋观察，弃去24 h内的死胚。12 d后，无菌收集有典型病变鸡胚的脑、胰腺、胃肠道以及尿囊液；用所收集尿囊液作为稀释液处理病料，研磨、冻融后即为第1代病料样品（F1）和传代材料，盲传3代后同上收集病料。将收集的样品用琼脂扩散试验（AGP）检测。

1.5 人工感染试验 将1日龄非免疫鸡随机分为2组，每组10只。第1组为试验组，每只雏鸡脑内接种琼扩试验呈阳性的病毒液0.05mL；第2组为对照组，每只雏鸡脑内接种0.05mL生理盐水。隔离饲养、观察，并记录发病情况和病死鸡的病理变化。

1.6 AEV YL株VP1基因的克隆 按照RNAiaso Plus说明书和反转录试剂盒说明书进行病毒RNA的提取与反转录，置于-20℃备用。根据GenBank中AEV 1143株基因序列（登录号：AJ225173.1）设计1对特异性引物，上、下游引物分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点（下划线部分），上游引物P1：5′-GAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGA-3′；下游引物P2：5′-ACGCGTCGACCTACTCTTCTACCAACT C-3′。以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经纯化后克隆至pMD18-T Simple载体，进行测序。

1.7 AEV VP1基因的序列分析 用DNAStar生物软件对AEV YL株VP1基因序列进行分析，并与已知的AEV VP1序列进行比较。AEV VP1基因的参考毒株有1143株、VR株、L2Z株、SX株、HB株、SD株和NH937株，其中1143株、VR株和L2Z株Gen⁃Bank的登录号分别为AJ225173.1、AY466473.1、AY275539.1和JN986828.1，HB株[3]、SD株[3]和NH937株[4]没有登录号，序列来自文献[3-4]。

2 结果

2.1 病毒分离与鉴定 将病料接种6日龄SPF鸡胚，连续传至第3代时，收集处理的病毒样品做琼扩试验。可看到4个（1个F1、3个F3）分离样品与标准AE阳性血清之间出现特异性沉淀线，而与SPF鸡血清之间没有沉淀线，表明该分离株为禽脑脊髓炎病毒，命名为AEV YL株。

2.2 人工感染试验 试验组雏鸡在接种后7 d，5只开始出现临床症状，继续观察至10 d，又有3只发病，共计发病8只，5只很快死亡，临床表现精神委顿、易受外界惊吓、震颤、站立不稳、共济失调等症状；剖检病死鸡可见内脏器官无明显病变，大脑有轻微的水肿和软化，大脑与脑壳粘连。采集病料进行AGP检测，发病鸡脑组织均为AE阳性。对照组雏鸡未见发病。

2.3 VP1基因的RT-PCR扩增 从分离到的病毒材料中提取RNA，反转录后经PCR扩增得到AEV YL株的VP1基因，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，发现在810 bp处有特异性条带（图1），与预期结果相符。

图1 VP1基因PCR扩增结果

2.4 阳性克隆的鉴定 PCR产物纯化后克隆至pMD18-T载体，提取重组质粒（pMD18-T-VP1），用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，结果在2 692 bp和810 bp处有特异性条带(图2)，与预期相符。以上结果表明，AEV YL株VP1基因已经正确插入到pMD18-T载体中。

图2 重组质粒pMD18-T-VP1酶切鉴定

2.5 AEV YL株VP1基因的序列测定 测序结果显示，AEV YL株VP1基因全长为810 bp，编码270个氨基酸残基。利用Prot Param对YL VP1蛋白的一级结构进行生物信息学预测，VP1蛋白的分子质量为30.45 ku，理论等电点（p I）为5.12，原子个数总计8 535个，分子式为C2446H4084N810O1024S171。

2.6 AEV YL株VP1基因的同源性分析 应用Blast、DNAStar生物软件，将测得的AEV YL株的VP1序列与SX株、1143株、VR株、L2Z株、HB株、SD株和NH937株的VP1基因序列比较，发现没有插入和缺失。表1的结果表明，YL株与参考毒株的VP1基因同源性为92.0%～99.8%，推导的氨基酸同源性为89.3%～99.3%。YL株与SX株相比有7个碱基发生改变，同源性为99.1%；与1143株、L2Z株同源性最高，只有2个碱基不同，同源性为99.8%；与内蒙古分离株同源性最低，仅有92.0%。

表1 不同毒株AEV VP1基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性

2.7 AEV VP1基因进化分析 根据AEV VP1基因的核苷酸差异性，将YL株与已知的AEV毒株建立遗传进化树（图3）。进化树分析结果显示，YL株与1143株、L2Z株处于1个分支，亲缘关系较近；与陕西分离株SX处于1个大的分支，亲缘关系也较近；与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远。

图3 AEV VP1基因（核苷酸）系统进化树

3 讨论

本次发病种鸡的品种为尼克红，在241日龄时出现产蛋量突然下降26%左右，持续10 d后逐渐恢复。产蛋下降期间所产种蛋的孵化率明显降低，死雏、弱雏明显增多，病雏精神沉郁，不愿走动，共济失调，头颈部快速震颤，最后衰竭死亡。对死雏进行剖检，在腺胃壁表面可见少量灰白色区域，脑组织有轻微水肿、充血，其他脏器无明显病变[5-6]，初步怀疑为禽脑脊髓炎。采集病雏脑组织和十二指肠，研磨处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离，盲传3代收集病毒样品进行AGP检测。试验结果显示，阳性血清与空白对照之间未出现沉淀线，而与标准抗原和1个（F1代）、3个（F2代）样品之间出现了沉淀线，因此可以初步确定，阳性血清与待测样品之间的沉淀线为AEV抗原抗体特异性沉淀线，即所分离到的病料中含有禽脑脊髓炎病毒。

在人工感染试验中，接种的10只1日龄雏鸡中有8只发病，病鸡表现出较为典型的AE症状，即体质较弱，见有震颤、站立不稳、行走困难、共济失调等，死亡后剖检，脏器无明显的病理变化，仅大脑略有异常，有轻微的水肿和软化，与脑壳粘连，这些特征与吴志强[7]，周铁忠[8]等描述的禽脑脊髓炎病毒感染雏鸡的情况部分类似。采集试验组病死鸡病料进行AGP检测，发病鸡脑组织均为AE阳性，对照组雏鸡未见发病。人工感染试验的结果进一步表明，分离到的病料中含有禽脑脊髓炎病毒。此外，吴志强等[7]发现患病雏鸡被驱赶时，行走不能控制，以跗关节和胫关节着地，后期两肢麻痹、瘫痪，本试验中没有发现；周铁忠[8]在AEV感染的病雏中发现部分鸡一侧眼睑麻痹，眼睛半闭或全闭，该侧眼分泌物增多，晶状体逐渐浑浊褪色，在本试验中也没有看到。可能是由于这些病变并非具有典型性和特异性，不是在发病的每个雏鸡身上都有表现。

本试验根据已发表的AEV 1143株的序列，设计特异性引物，利用RT-PCR方法对AEV陕西分离株的VP1基因扩增并测序，结果上传到Gen⁃Bank，登录号为：JQ894852。测序结果显示，AEV YL分离株VP1基因全长为810 bp，编码270个氨基酸，分子量大小约为30.45 Ku。应用DNAStar分析软件对AEV YL分离株VP1基因的核苷酸序列与GenBank中已登录的毒株比较发现，YL株与1143株等毒株的VP1基因核苷酸序列同源性为92.0%～99.8%，氨基酸序列同源性为89.3%～99.3%；AEV YL株与SX株的同源性为99.1%，有7个碱基发生改变，其编码的氨基酸序列有5个氨基酸残基发生改变。系统进化树分析显示，YL株与1143株、L2Z株处于一个分支，亲缘关系较近；与陕西分离株SX处于一个大的分支，亲缘关系也较近；与VR株、HB株、SD株和NH937株处于不同的分支，亲缘关系较远。经分析表明，AEV不同毒株VP1基因存在一定程度的差异，并不是高度保守的，与韦莉等[9]的研究结果有所不同。本试验为AEV的基因序列补充了新的数据，为陕西禽脑脊髓炎的诊断与预防提供了理论依据。

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