IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

柳舒航，韦 莉，王 菁，朱姗姗，张春燕，阎 旭，全 荣，李子璇，刘 爵

(1.北京农学院动物科学技术学院，北京 昌平102206；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀100097）

鸡传染性囊病(Chicken infectious bursal dis⁃ease，IBD)是由传染性囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种危害幼鸡的急性、高度接触性传染病。该病能破坏鸡中枢免疫器官称腔上囊，引起严重的免疫抑制，主要抑制体液免疫，其次是局部免疫，再次是细胞免疫[2]，并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败。特别是近年来超强毒株[2]的出现，发病鸡的死亡率大大提高，给世界各地的养禽业带来了巨大的经济损失，也给禽病工作者带来了新的挑战。

IBDV属于双核糖核酸病毒科，其基因组由A、B两个片段的双链RNA组合而成，其中A片段主要编码一种前体多聚蛋白NH2-VP2-VP4-VP3-COOH[3-4]，该多聚蛋白在翻译后进一步加工形成VP2、VP4和VP3蛋白；B片段主要编码VP1蛋白。其中，VP2和VP3是IBDV的结构蛋白，构成病毒核衣壳的主要成分。VP2具有血清型特异性、含有能诱导中和抗体的构象依赖性抗原决定簇，是IB⁃DV的保护性抗原，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV的感染。

果蝇表达系统（Drosophila expression system，DES）属于真核表达系统中昆虫表达系统的一种，与昆虫杆状病毒表达系统十分相似。DES的表达产物具有与天然产物相似的理化和生物学特性，能对蛋白质进行正确的翻译后加工修饰，同时DES同时具有昆虫高水平表达和哺乳动物稳定表达的优点，而且表达产量高，适合大规模生产，现已广泛用于多种外源基因的表达[5-6]。

本研究进行了IBDV VP2基因的分子克隆及果蝇S2细胞真核表达系统的表达，为IBDV诊断抗原、亚单位疫苗的研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系、菌种和载体 S2果蝇细胞系(Sch⁃neider 2 Cells)、果蝇系统表达载体pMT/BiP/V5/Hi⁃sA及抗性筛选质粒pCoHygro均为本实验室保存，菌株E.coli DH5α，购自TaKaRa公司，含有VP2蛋白基因序列的重组质粒为本实验室保存。

1.2 主要试剂 PrimeSTARHSDNA Polymerase购自，TaKaRa公司；Trans2K DNA Marker，购自Trans⁃gen公司；快速凝胶回收试剂盒和小量质粒DNA提取纯化试剂盒，购自Omega公司；限制性内切酶EcoR I、Xho I和磷酸酶抑制剂，购自NEB公司；QIAquick PCR Purification Kit、Ni-NTA蛋白纯化试剂盒，购自Qiagen公司；T4 DNA连接酶，购自Fer⁃mentas公司；通过小鼠腹水制备的VP2蛋白单克隆抗体由本实验室保存。

1.3 引物的设计、合成与PCR 根据GenBank上发表并合成的IBDV VP2基因序列，用Oligo6.0软件设计一对特异性引物(F1/F2)，F1：5′-CATG CCATGG ATGGTTAGTAGAGATCAGAC-3′，5′端加上Nco I酶切位点；F2：5′-AT GAATTC CTCAGGCTTCCTTG⁃GAAGGTCAC-3′，5′端加上EcoR I酶切位点。其扩增片段长度为1 323 bp，引物由Invitrigen公司合成。

按照PCR说明书进行常规操作。取重组质粒作模板0.2μL，加入VP2引物F1、F2各1μL，dNTP 4μL，5×Buffer 2μL，Prime STAR 0.2μL，加ddH20至20 μL。PCR反应循环程序如下：95℃预变性5min后，以94℃30 s，55℃1.5min，循环35次，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析，参照OMEGA公司快速凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。

1.4 真核表达载体的构建和鉴定 取回收的PCR产物，用Nco I和EcoR I双酶切，同样双酶切真核表达载体pMT/BiP/V5/HisA，并纯化回收线性化载体。将线性化载体进行去磷酸化处理，与PCR片段以适当比例于22℃用T4连接酶连接过夜，用重组质粒转化大肠杆菌DH 5α宿主菌。挑选阳性克隆进行酶切及PCR鉴定。将鉴定正确的质粒送Invitrogen公司测序，以确定VP2基因插入的正确性。

1.5 果蝇S2细胞的稳定转染与筛选 按照Qiagen大提质粒试剂盒说明书提取重组质粒及转染辅助质粒，得到重组质粒和辅助质粒的浓度分别为460.3μg/mL和650.5μg/mL。果蝇S2细胞的转染方法参照Invitrogen试剂盒说明书。将2mL含3×106的果蝇S2细胞的完全培养基接种于6孔细胞培养板，28℃无CO2温箱培养过夜，直到细胞达到对数生长期（2～4×106/mL）。对于每一孔细胞，准备转染试剂如下：A液（2mol/LCaCl236μL，重组质粒19μg，pCoHygro 1μg，加去离子水至300μL)，B液（300μL 2×HBS）。用枪头逐滴缓慢地将A液加入到B液中，边加边用吸管吹打混匀。将所得溶液于室温孵育30min～40min，至形成沉淀。不要吹打沉淀，将混合液逐滴加入细胞培养板中，边加边混匀。28℃无CO2温箱培养16 h～24 h。同时，设立pMT/BiP/V5/HisA空质粒为对照组。

第2天，离心弃去含有磷酸钙的培养基，用新鲜完全培养基重悬，28℃无CO2温箱培养2 d后用含600mg/L抗生素Hygromycin B进行筛选。每隔4 d～5 d更换新鲜的抗性培养基，直到抗性细胞产生。

1.6 表达产物的IFA鉴定 将抗性细胞及正常S2细胞以合适密度铺到96孔板中，加入硫酸铜至终浓度500μmol/L，诱导表达72 h后，弃上清，用PBST洗3遍，固定封闭后，将VP2单抗1∶200稀释，4℃孵育过夜，用FITC荧光二抗1∶50稀释，37℃孵育2 h，洗板后，荧光显微镜下观察。

1.7 重组蛋白的纯化 由于本研究中表达的重组蛋白在羧基末端带有6×His标签，因此可用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。按照Qiagen纯化蛋白试剂盒说明，在非变性的条件下，将诱导表达后的S2细胞裂解、离心，将上清通过Ni-NTA柱，收集洗脱液，测其浓度为2.029mg/mL。

1.8 表达产物的SDS-PAGE分析 将诱导表达后的空细胞、阳性克隆细胞离心后用PBS重悬，和纯化的VP2融合蛋白一起加入load Buffer缓冲液变性10 min后，上样跑SDS-PAGE蛋白电泳进行分析。

1.9 表达产物的Western-blotting分析 诱导表达后，将细胞全蛋白、表达上清及纯化的VP2融合蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳后，转移到NC膜上，将VP2单抗1∶4 000稀释，HRP IgG二抗1∶8 000稀释，进行Western-blotting鉴定。

2 结果与分析

2.1 VP2基因的PCR扩增结果 应用特异性引物对PUC57-VP2蛋白基因序列进行扩增，结果与预期片段大小相符（图1）。

图1 VP2基因的PCR扩增

2.2 重组质粒pMT/BiP/V5/HisA-VP2的酶切与PCR鉴定结果 将重组质粒进行Nco I和Xho I双酶切与PCR鉴定，获得与预期大小一致的片段（图2、图3）。

图2重组质粒双酶切鉴定

图3 重组质粒PCR鉴定

2.3 IFA分析结果 荧光显微镜下观察，正常S2细胞没有荧光，能够稳定表达的S2细胞呈现绿色荧光（图4）。

图4 表达S2细胞的IFA鉴定

2.4 SDS-PAGE分析结果 对空细胞、阳性克隆细胞及纯化的VP2融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析（图5）。

图5 表达重组蛋白的SDS-PAGE鉴定

图6表达重组蛋白的Western-blotting鉴定结果

2.5 Western-blotting分析结果 利用Westernblotting对细胞全蛋白、表达上清及纯化的VP2融合蛋白进行特异性鉴定。结果49 kDa处有一条较深的显色带，说明VP2融合蛋白具有抗原活性（图6）。

3 讨论

IBDV出现的初期是以经典毒株（cIBDV）为主要流行株，当时发病率高而死亡率不高[7]，后来，相继出现了抗原变异株（vIBDV）和超强毒株（vvIB⁃DV），尤其是超强毒株，可引起60%～100%的死亡率，对养鸡业的危害更大，使该病的防治面临新的困境。VP2蛋白是IBDV重要的结构蛋白，更是重要的宿主保护抗原，多种变异发生在不同分离株病毒基因的这个结构。所以进行VP2蛋白全基因的克隆和表达能够减少结构的变异，从而减少或消除中和反应[8]。

本研究进行了IBDV VP2基因在果蝇S2细胞表达系统中的表达研究。果蝇表达系统使用果蝇S2细胞为表达宿主，且有多种表达载体，包括组成型或诱导型表达载体，可以进行重组蛋白的胞内、分泌或连续表达，可以适应不同的需要。在室温下，不需要任何特殊环境，果蝇S2细胞就可以在无CO2和无血清条件下培养[9]，它既可以在培养瓶中松散半贴壁单层生长，同时也可以很好的适应摇瓶和发酵罐的悬浮培养[10]。外源基因在S2细胞系一般能够达到500～1 000个拷贝。

本试验中所选取的表达载体pMT/BiP/V5/HisA是一种分泌型载体，此表达载体使用果蝇金属硫蛋白基因（MT）启动子。MT启动子是一个严谨调控的强启动子，即使在很高的拷贝数下也可以维持低水平的本底表达。硫酸铜或氧化镉可以解除抑制，表达MT启动子的下游基因。DES的表达载体均没有果蝇细胞的筛选标记，只能用于短期表达。要建立稳定表达的细胞株，必须将带有外源基因的载体和筛选载体共转染。常用的筛选载体有携带潮霉素抗性基因的pCoHygro和携带有灭瘟素抗性基因的pCoBlast。将筛选载体和表达载体共转染宿主细胞，即可根据宿主耐药性选出高拷贝的细胞株。

本研究仅是初步探索了IBDV VP2基因在S2果蝇细胞中的表达情况，为更加深入地研究IBDV VP2基因的功能及其他重组蛋白的表达提供了重要参考。总之，IBDV VP2基因在果蝇S2细胞中的成功表达为IBDV诊断抗原及基因工程疫苗的研制奠定了基础，进而为预防IBDV在我国的流行提供有力的检测和预防工具。

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