白头翁汤提取工艺的研究及薄层鉴别优化
2014-03-11张启迪
张启迪，张 慧，邹 明，单 虎
（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛266109）
白头翁汤为清热解毒、凉血止痢的中药汤剂，始出于张仲景的《伤寒论》。该方由白头翁15 g、黄连6 g、黄柏12 g、秦皮12 g 4味药组成。其中，白头翁为毛莨科多年生草本植物白头翁的干燥根，具有清热解毒，凉血止痢之功效，为白头翁口服液中的君药。黄连苦寒，泻火解燥湿厚肠，为治痢要药；黄柏清下焦湿热，2药共助君药清热解毒，尤能燥湿治痢，共为臣药[1]。秦皮为木犀科白蜡树植物的干燥树皮，味苦，性寒，用于热痢泄泻，目生翳膜等[2]，为白头翁口服液中的佐药。该方证原为治湿热痢疾的首选方剂[3]。近年来随着研究者对白头翁汤的深入研究，在兽医临床上也逐渐广泛应用。肖琛闻等[4]曾采用白头翁汤治疗鸭疫里默氏菌病，结果该方能改善症状并减少死亡率。祝国强等[5]试验证明，白头翁汤对沙门菌接种的鸡胚有较好的保护作用。
随着该药的广泛生产使用，进一步充分提取药物有效成分、优化鉴别方法成为研究热点。本文旨在通过单煎、两两合煎和全方合煎来比较不同配伍对沉淀量产生的影响来优化煎煮方法，通过不同提取次数得到的出膏率筛选最佳提取工艺，对各药材进行薄层色谱鉴别时改变氨水添加顺序，以优化药物薄层鉴别方法，进一步推动白头翁汤在临床上的应用，来更好地适应市场的需求。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药材与试剂 黄连对照药材（批号：Z00107 04）、秦皮对照药材（批号：Z0070607）、盐酸小檗碱对照品（批号：Z0220712）、白头翁皂苷B4对照品（批号：111766-200601），均购自中国兽医药品监察所；药材白头翁、黄柏、黄连和秦皮，均购自安徽广印堂制药有限公司；乙醇、甲醇、苯、甲苯、甲酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、浓氨水、浓硫酸等均为分析纯。
1.1.2 仪器设备 CB10-UV6E1型多功能暗箱式紫外分析仪（北京赛百奥科技有限公司）；GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；DS-671型电子称（上海金山亭林工业开发区）；HC-3018型普通高速离心机（安徽科大创新股份有限公司）；5.0μL微量进样器（上海安亭微量进样器厂）；KMD型控温电热套（鄄城华鲁电热仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试验前准备 药材预处理：将秦皮、黄连、黄柏3种药材分割成长约0.5 cm左右的块段，保证干燥，称量备用；容器编号；清洗滤布；将硅胶G板分割成长宽为10×5 cm的小板；校正pH计；仪器的清洗烘干等。
1.2.2 提取次数对出膏率的影响 按处方量称取药物，加8倍量水浸泡30min，煎煮，每次0.5 h，提取次数分别设定为2次、3次和4次。4层纱布过滤提取液，合并滤液，冷却后于4℃冰箱过夜，过滤，浓缩至约60mL后倒入垫有锡纸的托盘，105℃烘箱烘至恒重，称量干膏重量并计算出膏率（出膏率=干膏重量/全方药物干重×100%）。
1.2.3 药材配伍对沉淀量的影响
1.2.3.1 单味药水煎 遵照处方中药物含量称取各药材，每种药各加入8倍量水，浸泡30min后均煎煮3次，每次0.5 h，水提液滤过后合并，浓缩至25mL，冷却至室温，摇匀后取10mL加入刻度离心管，离心5min（4 000 r/min），观察计算各药沉淀百分比（沉淀百分比=沉淀干重/药材干重）。求和计算占取全方剂含量的沉淀百分比。
1.2.3.2 两两药合煎 将4味药按处方量两两混合，共搭配3组，分别加入8倍量水，以下操作同上，计算两两药沉淀百分比后，求取每组全方剂的沉淀比例，并对3组处方沉淀百分比求平均。
1.2.3.3 全方合煎 按处方量称取药物，加水360mL，浸泡30min后合煎水提3次，每次0.5 h，过滤，合并滤液，浓缩至45mL，摇匀后取10mL于刻度离心管，4 000 r/min离心5min，计算沉淀百分比。
1.2.4 氨水添加顺序对黄连、秦皮薄层鉴别的影响
1.2.4.1 黄连鉴别（1）先氨水处理，后展开：取1.5 mL白头翁汤，加10mL甲醇，摇匀，作为供试品溶液。取0.2 g黄连对照药材，加10mL甲醇，加热回流15min，过滤，滤液作为对照药材溶液。取盐酸小檗碱对照品2.5mg，加5mL甲醇，作为对照品溶液。吸取以上3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，先用浓氨水饱和蒸气处理，后以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1）为展开剂展开，取出，晾干，检视（365 nm紫外光灯下）。
（2）氨水与展开剂同置：吸取以上3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，将浓氨水和展开剂同置，展开，取出，晾干，同样条件下检视。
（3）先展开，后氨水处理：吸取以上3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，展开剂展开后，用浓氨水处理，取出，晾干，同样条件下检视。
（4）未使用氨水：吸取以上3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，展开剂展开，取出，晾干，同样条件下检视。
1.2.4.2 秦皮鉴别 （1）先用氨水，后展开：取3.5 mL白头翁汤，加10mL乙醇，摇匀，作为供试品溶液。取秦皮对照药材1 g，加10mL乙醇，加热回流10min，滤过，滤液作为对照药材溶液。吸取以上两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，先用浓氨水饱和蒸气处理，再以正丁醇-三氯甲烷-甲苯-甲酸（8∶1∶1∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。
（2）氨水与展开剂同置：方法同2.4.1.2。
（3）先展开，后用氨水：方法同2.4.1.3。
（4）未使用氨水：方法同2.4.1.4。
2 结果与分析
2.1 提取次数对出膏率的影响 不同提取次数下所得的出膏率值，结果见表1。
表1 提取次数对得膏率的影响
通过称量、计算，得出提取次数为4次时出膏率最高为29.47%。
2.2 药材配伍对沉淀量的影响
2.2.1 单味药水提取沉淀量结果 结果见表2。
经称量计算单味药水提所得沉淀量占全方剂的百分比为12%。
2.2.2 两两药合煎沉淀量结果 结果见表3。
经过称量计算，三组两两合煎的全方剂沉淀百分比分别为9%、7.5%、8.5%，对其求平均，最终沉淀百分比为8.3%。
表2 单味药水煎沉淀量比较
表3 两两药合煎沉淀量比较
2.2.3 全方合煎沉淀量结果 经过称量计算，全方煎煮产生的沉淀量百分比为6%。
2.3 氨水添加顺序对黄连、秦皮鉴别的影响结果总结如表4。
3 结论
3.1 提取次数对出膏率的影响 不同提取次数对出膏率有一定影响，本试验最佳提取次数为4次，出膏率最高为29.47%。
3.2 药材配伍对沉淀量的影响 药材配伍不同，沉淀量大小有所差异。结果显示，药物两两合煎沉淀量较各药单煎沉淀量少，而全方煎煮产生的沉淀百分比最少，且操作简单。
表4 氨水添加顺序对黄连、秦皮鉴别的影响
3.3 氨水添加顺序对黄连、秦皮鉴别的影响结果 氨水添加顺序对药方中秦皮、黄连的薄层鉴别有不同影响。浓氨水预饱后展开的黄连薄层鉴别效果更好，而秦皮的鉴别则不需经过浓氨水的处理。
4 讨论
4.1 提取工艺的优化 该试验中通过表4，提取4次出膏率最高为29.47%，提取2次出膏率最低21.90%，得到出膏率与提取次数呈正相关关系，为白头翁汤的临床应用提供了可靠的依据。
据相关研究表明，白头翁汤剂在煎煮过程中会产生大量的沉淀[6]。不同的煎煮方法产生的沉淀量不同，本试验结果为白头翁汤全方合煎沉淀比例最少，两两合煎次之，单味药的煎煮沉淀比例最多。由此可推出，白头翁汤的提取应选择全方合煎提取，这样大大地提高了白头翁汤的临床药效物质成分的含量。并推测白头翁汤各原料药材在合煎时可能有增加溶解度的作用，这与时维静等[7]在白头翁汤提取工艺试验研究中的结论相同。
4.2 薄层鉴别方法的优化 参考2010年版《中华人民共和国兽药典》，对于白头翁汤中药材的鉴别方法进行研究。由表4结果可知，通过改变氨水添加顺序来研究其对秦皮、黄连鉴别的影响，得出浓氨水与展开剂同置使黄连的鉴别效果最好，而秦皮的鉴别则不需经过浓氨水的处理，这与侯丽丽等[8]等研制结果相符。尤其指出，对于秦皮的鉴别，浓氨水不可与展开剂同置，否则会产生结晶，造成检测成分无法展开。
本试验在提取工艺上只对提取方法和提取次数两个因素进行了考察，对于整个制备工艺来说尚有更多影响因素有待考察。而对影响白头翁汤中黄连、秦皮的薄层色谱鉴别条件的研究，是在确保鉴别的专一性和准确性的基础上，使目标成分可以得到有效分离，斑点清晰，背景几乎无干扰，进而使检验方法得以优化，为今后白头翁汤的鉴别提供理论依据。
[1]曲龙妹，赵春杰，李丹，等.正交试验优选白头翁汤提取工艺[J].中国药房，2009，20（12）：904-906.
[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第六卷）[M].上海：上海科学出版社，1998：163-167.
[3]孙俊颖，彭新宇，魏光伟，等.白头翁汤的药理作用研究进展[J].广东农业科学，2012（12）：112-113.
[4]肖琛闻，鲍国连，韦强，等.中药方剂对鸭疫里氏杆菌病的治疗效果研究[J].中兽医学杂志，2010（1）：6-9.
[5]祝国强，侯凤琴，钟翠红，等.白头翁汤抑制感染鸡胚死亡和防治肉鸡白痢的试验[J].黑龙江畜牧兽医，2008（3）：84-85.
[6] 朱华旭，丁林生.白头翁汤沉淀化学成分研究[J].中成药，2002，24（4）：293-296.
[7]时维静，崔全民，李立顺.白头翁汤提取工艺试验研究[J].中国试验方剂学杂志，2006，12（5）：1-3.
[8]侯丽丽，柴桂珍，马泽宁.关于白头翁散中秦皮薄层鉴别方法的探讨[J].中国兽药杂志，2008，42（2）：52-53.
