BACE2 多态性位点rs1046210 与阿尔茨海默病相关性的研究

于跃怡，许二赫，薛素芳

自从1907 年阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)被报道以来，人们一直在探索该病的病因。虽然确切发病原因还不清楚，但是可以肯定它与机体的衰老、环境及遗传有关。目前大量资料表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积在AD 的发病中起到了非常重要的作用。Aβ 的形成不仅与β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)相关，还与裂解APP 的个蛋白酶具有直接的关系。APP 代谢过程涉及3 个酶，即α-、β-、γ-分泌酶。β-分泌酶是Aβ 形成的限速酶，现已克隆出一种具有β 分泌酶活性的蛋白酶，称为APPβ 位点裂解酶(βsite APP cleaving enzyme，BACE1)。BACE1 是一种跨膜精氨酸蛋白酶，在各种组织均有表达，在脑组织表达水平较高［1，2］。近年来发现了位于第21 号染色体长臂的BACE2，因其与BACE1 具有高度同源性，也引起了学者们的广泛关注［3～5］。

但是，针对BACE2 的研究结果并不完全一致。Myllykangas 等对芬兰大于85 岁的老年人群进行流行病学调查，发现位于BACE2 第5 和第7 外显子的多态性与散发性阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer’s disease，SAD)相关［6］。Nowotny 等对美国12 例家族性痴呆的患者进行了血清学的检测，发现BACE2内含子和第7 外显子的多态性与对照组没有统计学差异［7］。我们早期的研究中已经对中国北方汉族人群中SAD 和正常对照组BACE2 基因5’非翻译区的3 个多态性位点进行了对比分析研究，没有发现统计学差异［8］。那么，该基因的外显子区域多态性是否与SAD 的发病有关呢?针对这个问题，我们设计了该项实验，旨在探讨BACE2 第7 外显子区域多态性位点与中国北方汉族人群SAD 发病的关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象资料 AD 组包括348 例散发性阿尔茨海默病患者，男170 例，女178 例;平均年龄73.6±9.1 岁，平均发病年龄:69.45±6.31 岁;为2000 年～2008 年首都医科大学宣武医院、北京市老年病医院、北京市10 家老人院及秦皇岛海港区社区的患者。所有患者均进行MMSE 评分和Hachinski缺血评分。采用美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默氏病和相关疾病协会的临床诊断标准，把诊断为“很可能AD”的患者列为研究对象。患者具备至少一名神经科专科医生的临床诊断证明。全部患者无家族史，且均为连续3 代生活在中国黄河以北的中国北方汉族人群。全部患者或其监护人均签署知情同意书。

对照组包括健康老年人294 例，男136 例，女158 例;平均年龄70.0±7.3 岁;均为2000 年～2008年间宣武医院门诊体检者及秦皇岛海港区退休人员体检者，且均经MMSE 评分、Hachinski 缺血评分和门诊系统体检证实为健康人。全部健康老年人家族中均无痴呆患者，均为连续3 代生活在中国黄河以北的中国北方汉族人群。全部对照组签署知情同意书。

1.2 实验方法 随机选取10 例SAD 患者DNA 标本和10 名正常对照者DNA 标本，根据NCBI数据库的基因序列，用标准PCR 方法扩增BACE2基因第7 外显子区域，用直接测序的方法对其进行系统筛查。对筛查中发现的rs1046210 多态性位点使用微测序的方法进行多态性分型。PCR 产物由中国北方基因中心及北京擎科生物技术有限公司测序。微测序由上海南方基因有限公司协助完成。所有标本均根据文献方法进行载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)分型［9］。实验所使用BACE2 外显子7上游引物序列TCATCACCGTCACTCTTCCA，下游引物序列TCTGTTCCTCCATCCACCTC。

1.3 遗传学统计分析 结果使用HWE 程序检测Hardy-Weinberg 平衡。等位基因和基因型频率在患者和对照中的分布差别用SPSS17.0 统计软件包的卡方检验，用Logistic 回归校正年龄、性别和ApoE 状态。P＜0.05 视为有统计学差异。

2 结果

我们随机选取10 例SAD 患者和10 例正常对照者，对BACE2 第7 外显子区进行PCR 扩增和直接测序。发现中国北方汉族人群中存在一个多态性位点rs1046210C/T，该位点为沉默变异。

随后，我们采用微测序的方法对348 例SAD 和294 例正常对照组病例进行rs1046210C/T 分型，同时参照文献记载对样本进行ApoE 的分型。等位基因和基因型在SAD 组和正常对照组的分布频率(见表1)。该位点在SAD 组和正常对照组的基因型和等位基因分布符合 Hardy-Weinberg 平衡。对BACE2 第7 显子区域多态性位点的统计分析显示，rs1046210 多态性位点的基因型和等位基因频率均无统计学差异。我们对SAD 组和正常对照组中ApoEε4 的分布情况进行了统计分析，ApoEε4 在SAD 组中的比例明显高于正常对照组。然而，我们根据是否携带ApoEε4 等位基因进行进一步分层比较后，发现该位点仍然不具有统计学意义。在应用logistic 回归分析平衡了年龄、性别和ApoE 分型的影响后，该位点仍无统计学差异。

表1 rs1046210 位点基因型及等位基因在SAD 与正常人中的分布及比较

3 讨论

BACE2 基因位于第21 号染色体长臂，编码一种518 个氨基酸的跨膜的天冬氨酸蛋白酶［4］。以往的研究显示，在唐氏综合征伴有早发性痴呆的患者中存在BACE2 的过度表达［10，11］。这一发现引起了学者们的广泛关注，人们推测BACE2 也参与了AD 的病理过程。近年来，学者们纷纷对BACE2 外显子和一部分内含子的单核苷酸多态性进行了检测，但是检验结果并不完全一致。

在我们前期的实验研究中，对BACE2 基因5’非翻译区进行了筛查，发现了中国北方汉族人群中存在3 个多态性位点，对此3 个位点进行对比分析，没有发现统计学差异［8］。本次实验我们对BACE2 基因第7外显子区域进行了筛查，并对发现的多态性位点进行对比分析，依然没有发现统计学差异。我们的实验结果不支持BACE2 基因多态性与SAD 相关，这与Nowotny 及Gold 等人的研究结果相似。

2001 年Nowotny 等人对美国12 例家族性痴呆的患者进行了血清学的检测，发现了BACE2 第7 外显子上游10 bp 的多态性位点rs2252576 和第7 外显子的多态性位点rs1046210，这两个多态性位点均不导致氨基酸合成的置换，也不位于转录因子结合的位点。在实验组与对照组的检测中，二者的等位基因和基因型频率不具有统计学差异，他们认为BACE2 在AD 病理学上的意义仍不清楚［7］。

2003 年，Gold 等学者对96 例高加索人群中的晚发性AD 患者进行了研究，他们检测了rs1046210 和rs12149 两个多态性位点，其中rs1046210 位于外显子区域，但是为沉默变异，而rs12149 位于3’非翻译区。两个位点的等位基因和基因型频率在实验组和正常对照组人群中不具有统计学的差异，经过ApoEε4 分层研究后，数据仍然没有差异。因此，他们认为BACE2 基因的单核苷酸多态性与晚发性AD 无关［12］。

早在2000 年β 分泌酶被发现不久，Farzan 等人在论文中就表示，BACE2 可以在两个位点对APP 进行切割，其中一个是β 位点，另外一个是在Aβ 片段内部，一般状态下后者的切割功能较强［5］。2005年，在学者Sun 等人的研究中指出:尽管BACE1 和BACE2 具有高度同源性，但是它们分别具有不同的作用和启动子区域的转录调节，BACE2 在人体内并不行使β 分泌酶的功能，而是在Aβ 片段内部的α 位点附近进行切割分解Aβ［13］。在他们随后的研究还进一步显示:BACE2 是在一个新奇的θ 位点分解APP 并产生C80 片段，这一切割作用阻止了Aβ 的产生。转基因动物实验也证实了BACE2 的含量增加并不引起Aβ 的沉积，反而可以明显降低Aβ 的水平［14］。

我们的实验结果支持上述观点，并没有发现中国北方汉族人群中BACE2 第7 外显子区多态性变异与SAD 相关，但是我们尚不能排除该基因的其他区域存在有与SAD 相关的变异。因此，我们还需要进行进一步的基础研究和扩大样本量的研究来支持我们的观点。

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