硫化氢对短暂脑缺血/再灌注老年大鼠海马神经元Camkkβ、Bcl-2 和Bax 表达的影响

刘志成，章以杰，宋晓丽，夏连春，常国江，刘 涛，林 俊，田苗苗

缺血性脑血管病是危害人类健康最严重的疾病之一。临床上中老年人发生短暂性脑缺血/再灌注损伤的原因包括大量失血、一过性低血压等，因此如何减轻脑缺血再灌注损伤是近年临床研究的热点。Camkkβ 是一种激活钙调素依赖蛋白激酶的激酶，在中枢神经系统中表达量比较高［1］。研究显示，Camk 信号通路在神经细胞功能中的关键作用包括神经信号的传导、基因的转录、突触的形成及突触的可塑性和行为功能［2］。硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3 种气体信号分子。研究显示，硫化氢预处理可减轻心脏缺血再灌注损伤从而发挥心肌保护作用［3］。但硫化氢能否减轻短暂脑缺血再灌注老年大鼠海马神经元的损伤尚不清楚。本研究拟评价硫化氢对短暂脑缺血再灌注老年大鼠海马神经元Camkkβ、Bcl-2 和Bax 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备 动物分组:健康雄性SD 大鼠(青岛大学实验动物科学部提供)120只，月龄18～20 月，体重500～700 g，将大鼠随机分为对照组(C 组n=30)、缺血再灌注组(IR 组n=30)、H2S 组(H 组n=30)和生理盐水组(S 组n=30)。依据再灌注时间不同再分为1 d、3 d、5 d 3 个亚组。模型制备:采用Pusinelli 四动脉阻断法［4］制备大鼠短暂脑缺血/再灌注模型。腹腔注射10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g 体重)麻醉，5 min 内大鼠翻正反射消失，用钳夹四肢没有应激反应且无呼吸抑制为麻醉成功标志。暴露出第一颈椎双侧翼孔，将电烧灼器尖部伸入翼孔2.0～3.0 mm 烧灼翼孔，电凝下面走行的椎动脉。暴露出双侧颈动脉鞘，钝性分离出颈总动脉。用手术丝线环颈总动脉标记，并逐层缝合切口。手术结束让其自然苏醒。上述手术结束1 d 后，大鼠在清醒状态下仰卧位固定于实验台上，腹侧颈部切口用2%利多卡因局部麻醉。打开颈部切口，提起线环暴露双侧颈总动脉，用无损伤动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉，达到3 min 后撤去血管夹，恢复血流。模型成功的标准为双侧颈总动脉夹闭后30 s～1 min 内，大鼠意识丧失，眼球灰白，瞳孔变大，翻正反射消失，四肢僵直。不符合上述标准者被剔除。H 组于缺血前10 min 腹腔内注射H2S 外源性供体NaHS(14 μmol/kg);S 组注入等量的生理盐水;C 组不行任何处理。缺血3 min 后按再灌注时间1 d(T1)、3 d(T3)、5 d(T5)。所有实验动物均术前禁食12 h，不禁水，术中及术后维持肛温在37 ℃，术后单笼饲养。

1.2 神经行为学评分 脑缺血/再灌注后24 h，采用双盲法评估并记录每只小鼠神经行为学评分，根据Lawner 等制定的评分标准［5］对大鼠进行评分。评分标准包括6 个方面:眼睑下垂情况(正常，0 分;一侧眼睑部分下垂，1 分;一侧眼睑完全下垂，2分;两侧眼睑部分下垂，3 分;两侧眼睑完全下垂，4分);毛发竖立情况(正常，0 分;出现毛发竖立，1 分);肢体肌张力(正常，0 分;肌力下降，1 分);屈肌反射(正常，0 分;后肢屈肌反射下降，1 分;后肢完全不能屈曲，2 分);姿势(正常，0 分;伏首前倾，1 分);行走方式(正常，0 分;速度减慢，1 分;不能行走，2 分)。

1.3 TUNEL 法检测神经元凋亡 于再灌注1 d、3 d、5 d 时，每组随机选取5 只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.45 ml/100 g 体重)，用甲醛灌注后断头取脑，将取出的脑组织放于4 ℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中后固定过夜，然后转放入30%蔗糖中脱水，4 ℃存放。用梯度酒精脱水，包埋脑组织。用多聚赖氨酸行防脱载玻片。显微镜观察切片:细胞核中显示有棕黄色颗粒的为TUNEL 阳性细胞，即凋亡细胞。每只动物取3 张连续的切片，每张切片在高倍镜下(×400 倍)随机选取海马CA1区不重叠的2 个视野，计数TUNEL 阳性细胞平均数，以个/高倍镜视野表示。每批实验都设阳性与阴性对照，以试剂公司提供阳性片为阳性对照，以PBS 代替一抗为阴性对照，以排除假阳性或假阴性结果。

1.4 Western-blot 法检测Camkkβ、Bcl-2 和Bax蛋白表达 于再灌注1 d、3 d、5 d 时，每组随机选取5 只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.45 ml/100 g 体重)。快速冰上断头取脑，分离出海马组织，迅速放入-80 ℃冰箱保存。蛋白变性，标本于-20 ℃冰箱保存。电泳槽通电，进行湿法转膜。一抗反应:脱脂奶粉配置的一抗稀释液3 ml，加入一抗，混匀，放入转膜后的PVDF 膜，赶出气泡并封口，4 ℃过夜。洗膜，孵育二抗，洗二抗，显影。

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分比较 与C 组比较，IR 组、H 组和S 组老年大鼠缺血/再灌注24 h 神经行为学评分升高(P＜0.05);与IR 组比较，H 组老年大鼠缺血/再灌注24 h 神经行为学评分降低(P＜0.05)。

2.2 大鼠海马TUNEL 阳性神经元计数比较与C 组比较，IR 组、H 组和S 组老年大鼠海马区TUNEL 阳性神经元计数升高(P＜0.05);与IR 组比较，H 组老年大鼠海马区TUNEL 阳性神经元计数降低(P＜0.05)(见表1)。

2.3 Western blot 法检测Camkkβ、Bcl-2 和Bax蛋白表达 与C 组比较，IR 组、H 组和S 组老年大鼠海马Camkkβ 和Bax 表达水平升高，Bcl-2 表达降低(P＜0.05);与IR 组比较，H 组老年大鼠海马Camkkβ 和Bax 表达水平降低，Bcl-2 表达升高(P＜0.05)(见表2)。

表1 4 组大鼠脑缺血/再灌注后大鼠海马区TUNEL 阳性神经元计数(±s，n=5)

表1 4 组大鼠脑缺血/再灌注后大鼠海马区TUNEL 阳性神经元计数(±s，n=5)

与C 组相比较* P＜0.05;与I/R 组比较﹟P＜0.05

表2 4 组大鼠脑缺血/再灌注后大鼠海马Camkkβ、Bcl-2 和Bax 蛋白表达比较(±s，n=5)

表2 4 组大鼠脑缺血/再灌注后大鼠海马Camkkβ、Bcl-2 和Bax 蛋白表达比较(±s，n=5)

与C 组相比较* P＜0.05;与I/R 组比较﹟P＜0.05

3 讨论

在大量临床工作中发现，老年人易受到脑缺血疾病的威胁，大量失血、休克、心跳骤停及手术中低血压，这些情况均可造成全脑缺血。经过抢救复苏后虽恢复大脑的血液供应但加重了大脑的功能障碍和组织损伤，临床称为脑缺血/再灌注损伤。目前研究发现脑缺血再灌注损伤主要涉及能量代谢、炎症反应、细胞凋亡及相关信号系统表达等复杂过程，其主要机制是细胞内钙超载、及白介素释放的共同作用，而细胞内钙超载是细胞不可逆性损伤的共同通路。

采用四动脉阻断法制备大鼠短暂脑缺血再灌注模型。结果表明，IR 组老年大鼠脑缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高，海马区TUNEL 阳性神经元计数升高，提示模型制备成功。参照文献［6］选择腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)。并观察硫化氢对于短暂脑缺血再灌注老年大鼠海马神经元Camkkβ、Bcl-2、Bax 表达的影响。

Camkkβ 是一种激活钙调素依赖蛋白激酶的激酶，属于众多钙调蛋白激酶中的一员，可以被细胞内Ca2+激活。Camkkβ 在中枢神经系统中表达量比较高，同时在睾丸、脾、肺中也有低水平表达。研究发现，Camkkβ/CaMKⅠ信号途径涉及轴突的生长、树突分支以及突触形成，参与与记忆有关的神经细胞骨架结构的重塑［7］。Bcl-2 与Bax 是Bcl-2 家族中最重要的一对相互拮抗的凋亡相关因子，Bcl-2 基因表达产物主要位于线粒体膜、内质网膜和核膜上，其功能与抑制细胞凋亡、延长细胞生存有关［8］，而Bax 的生物作用与Bcl-2 相反，当Bax 表达增高可促进细胞凋亡［9］。因此本研究采用Camkkβ、Bcl-2 和Bax 反映老年大鼠短暂脑缺血再灌注损伤的情况。

本研究结果表明，与IR 组比较，H 组大鼠脑缺血/再灌注24 h 神经行为学评分降低，再灌注后1 d、3 d、5 d 海马阳性神经元计数降低，Camkkβ 和Bax的表达降低，Bcl-2 表达上调，提示H2S 可通过降低海马神经元Camkkβ 和Bax 的表达，上调Bcl-2 来减轻脑缺血再灌注损伤。其机制可能是:胱硫醚-β-合酶(CBS)，是中枢神经系统合成H2S 的主要酶，分布于中枢神经系统的海马、小脑、皮质和脑干，因此CBS 的活性直接关系到脑内H2S 的水平。研究表明，H2S 的含量越低，细胞凋亡现象越严重［10］。细胞内钙超载是细胞发生不可逆损伤的共同通路。Ca2+是体内普遍存在的第2 信使，关系到人体内多种病理生理改变的信号通路。钙离子结合蛋白(CaM)是体内钙离子信号通路的Ca2+结合受体。CaM 需要与钙离子结合蛋白激酶(CaMKs)结合，来发挥多重效用。CaMKKβ 就是CaMKs 其中的一员［11］。当加入NaHS 后，由于NaHS 可解离成钠离子(Na+)和硫氢根(HS-)，HS-可与体内氢离子(H+)结合生成H2S，对CBS 的活性具有负反馈抑制作用［12］，使Ca2+内流减少，抑制神经元海马Camkkβ 蛋白表达，上调大脑皮质神经元中Bc1-2 表达，抑制Bax 表达，从而抑制神经细胞凋亡，保护短暂缺血/再灌注后的脑组织。

综上所述，硫化氢可通过降低神经元海马Camkkβ 蛋白的表达、上调Bc1-2 的表达、抑制Bax的表达来减轻短暂脑缺血再灌注损伤。

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