APOE ε4 等位基因与尿AD7c-NTP 联合检测在AD 早期诊断中的初步研究

郑 磊，魏 琰，张凤春，张金荣，刘红梅

阿尔兹海默病(alzheimer’s disease，AD)是一种严重的神经退行性疾病，临床上以记忆损失和认知功能下降为主，是老年痴呆的常见形式，极大的威胁老年人的生命及健康［1］。目前，AD 的诊断主要依据患者临床表现并结合电子计算机X 射线断层扫描技术，核磁共振及神经心理学量表等综合评价。然而，由于AD 的潜伏期较长，从症状出现到确诊一般要3 y 左右时间，且在AD 确诊时患者多已存在明显的神经元损害，而此时进行药物干预治疗的效果有限［2］。因此，探寻准确特异的生物标记物早期鉴别诊断AD易发人群，实现AD 早发现早治疗的目标已势在必行。本研究对APOE ε4 等位基因与尿AD7c-NTP 联合检测在AD 早期诊断中预测效果及临床意义进行探讨，以期为AD 易发人群鉴别及早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 所有研究对象均来自2012 年6 月～2013 年9 月我院神经内科收治患者202 例。入组标准:(1)符合中国精神障碍分类与诊断标准第三版(CCMD-3)有关精神分裂症及轻度阿尔茨海默病的诊断标准，由2 名副高职称以上的神经科医师明确诊断;(2)按照简易智能状态量表(mini mental state examination，MMSE)评分标准，临床诊断为认知功能正常者MMSE 评分均大于等于27 分，临床诊断疑似AD 患者MMSE 评分均小于等于17 分;(3)入组前无明显的抑郁症状，其汉密尔顿抑郁量表(hamilton depression scale，HAMD)评分均不少于14 分。排除标准:(1)长期大量服用抗精神病药物和曾有严重头部外伤史;(2)患者累及中枢神经系统功能的内科疾病;(3)患有严重精神疾病患者;(4)认知功能检查过程不能配合的患者。按照以上标准，共收集认知功能正常者90 例(对照组，90 例，平均年龄70.4±8.2 岁，MMSE=29.7±1.4)，临床诊断疑似AD 患者76 例(PAD 组，76 例，平均年龄72.2±9.2 岁，MMSE=16.2±2.6)，各组在年龄，性别，教育年限方面差异无显著性(P≥0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象空腹抽取静脉血10 ml，采用肝素锂抗凝保存，常温保存时间不多于24 h，晨尿30～50 ml，4 ℃保存时间不多于7 d。

1.2.2 仪器与试剂 酶标仪购自Thermo Fisher Scientific 公司，型号为MultiSkan FC;台式低温离心机购自Eppendorf 公司，型号为5810R;PCR 仪购自Bio-Rad 公司，型号为MyCycler;琼脂糖凝胶电泳仪购自北京六一公司，型号DYCP-31DN;核酸蛋白测定仪购自Eppendorf 公司，型号为BioPhotometer D30;

1.2.3 限制性内切酶基因亚型分型 利用Hixson 和Vernier 等［3］的PCR 及限制性内切 酶APOE 基因亚型分型方法，通过红细胞裂解液分离静脉血样本(10 ml)中的白细胞，白细胞经预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3 次后，提取基因组DNA 进行基因扩增，扩增引物为F4(5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)和F6(5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’)，扩增产物经HhaI 酶切(酶切位点为GCGC)后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳后分离条带的位置及数量区分不同的APOE 等位基因亚型。

1.2.4 酶联免疫吸附检测 尿AD7c-NTP 酶联免疫吸附检测试剂盒购自深圳市安群生物工程有限公司，严格按试剂说明书操作。

1.2.5 统计分析 采用SPSS17.0 统计软件对数据进行统计分析处理。符合正态分布的计量资料采用±s 表示，两组间差异比较采用t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APOE 等位基因在对照组、PAD 组中表达频率的比较 为确定APOE 等位基因是否在对照组和PAD 组中存在不同的表达频率，本研究利用Hixson 和Vernier 等［3］的PCR 及限制性内切酶APOE基因亚型分型方法，对所有166 例患者进行APOE等位基因的检测，结果显示PAD 组APOE ε4 等位基因较对照组的表达频率显著提高(P≤0.05)(见表1)，而APOE ε2 或ε3 等位基因对照组和PAD 组间中表达频率无差异(P≥0.05)(见表1)，提示，APOE ε4 等位基因可能与AD 的发生相关。

2.2 酶联免疫吸附检测对照组、PAD 组尿样中AD7c-NTP 的含量 酶联免疫吸附结果显示，尿样中AD7c-NTP 的含量在PAD 组中较对照组有显著升高(P≤0.01)(见表3)，提示尿样中AD7c-NTP 的含量变化与AD 相关。

2.3 APOE ε4 与AD7c-NTP 联合诊断与单独诊断比较 作为有效的AD 早期诊断的生物标记物，其必须拥有较高的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值。本研究对PAD 组中34 例APOE ε4等位基因阳性患者及对照组中71 例APOE ε4 等位基因阴性患者进行尿AD7c-NTP 检测(见表3)。结果显示，相比与单独检测，尿AD7c-NTP 在携带APOE ε4 等位基因的患者中的检测效果高于单独检测，提示APOE ε4 与AD7c-NTP 联合检测在AD 早期诊断中具有较好的预测价值。

表1 APOE 等位基因在对照组、PAD 组中表达频率的比较

表2 酶联免疫吸附检测比较对照组、PAD 组尿样中AD7c-NTP 的含量(±s，ng/ml)

表2 酶联免疫吸附检测比较对照组、PAD 组尿样中AD7c-NTP 的含量(±s，ng/ml)

表3 对照组和PAD 组中APOE ε4 与AD7c-NTP 联合检测比较

表4 APOE ε4 与AD7c-NTP 联合诊断与单独诊断效果比较

3 讨论

据统计，全球65 岁以上老人有13%发生AD，而85 岁以上老人AD 患病率高达45%，随着人口老龄化的加速，预计到2050 年，全世界将有8000 万人遭受AD 困扰［4］。目前，由于AD 病因及发病机制尚未阐明，治疗方法主要通过降低AD 的特征性病理特征如β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)寡聚合物、淀粉样斑块(amyloid plaques)、微管相关蛋白tau 聚合物和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)等，以期阻止疾病进展［5，6］。这种“减少毒素”的治疗策略在AD 发生的早期可以取得较好效果，但在AD 病程的中后期仅能缓解AD 的症状，无法遏制或逆转AD 的病程［7］。因此，探寻准确特异的生物标记物早期诊断鉴别AD 易发人群，监测病程进展和药物疗效，以实现AD 早发现早治疗的目标已势在必行。

近期，全基因组关联研究证实，载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)基因多态性与AD 发病风险关系密切，其APOE ε4 等位基因是AD 最强的遗传危险因素，与早发性和迟发性AD 发病风险增加呈正相关［8，9］。人APOE 存在3 种主要亚型即APOE2、APOE3、APOE4，分别由19 号染色体长臂上3 个等位基因ε2、ε3、ε4 编码产生，其全球基因频率分别为8.4%、77.9%、13.7%，然而，APOE ε4 在AD患者中的频率却高达40%。已经证实，APOE ε4 以剂量相关方式增加AD 的发病率并使患者发病年龄提前，Farrer 等［10］研究发现，91%的APOE ε4 纯合基因携带者在68 岁左右发病，约47%的APOE ε4 杂合基因携带者在76 岁时发病，而在APOE ε4 非携带者中，仅20%的人在85 岁时才发生AD。此外，在轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment，MCI)患者中，携带APOE ε4 的患者表现出更快的认知功能下降和记忆损失，而MCI 被认为是AD 的早期阶段，与AD 发病风险密切相关。APOE 是人体重要的载脂蛋白，其可通过介导脂质转运调节脂类平衡。在外周组织中，APOE 主要由肝脏和巨噬细胞产生，介导机体胆固醇代谢。已经证实，APOE4 与高血脂症和高胆固醇血症相关，而二者可引发动脉粥样硬化，冠状动脉心脏病和卒中等心脑血管病。在中枢神经系统中，APOE4 主要由星形胶质细胞产生，通过低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)和LDL 相关蛋白参与胆固醇平衡［11］。

大量研究表明，APOE 与Aβ 代谢密切相关，其基因亚型可强烈影响Aβ 沉积所形成的老年斑，并促进脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)发生，而Aβ 和CAA 正是AD 两个最主要的病理特征。免疫组化证据表明，APOE 与AD 患者大脑中的老年斑共同沉淀，且APOE ε4 携带者要显著多于非携带者(40.7%对8.2%)，而这种差异在50～59 岁之间最为明显［12］。Barthel 等［13］利用匹兹堡化合物B(pittsburgh compound B，PiB)PET 成像技术证实，APOE ε4 基因携带者在PiBPET 阳性AD 患者中的比率显著高于PiBPET 阴性患者(65%对22%)，提示APOE ε4 基因携带者拥有较多的纤维状Aβ 聚集，原因可能与APOE 参与调节大脑Aβ 代谢、聚集和沉积有关。已经证实，大脑Aβ 水平和淀粉样斑块的形成为APOE 亚型依赖(ε4＞ε3＞ε2)［14］。基础研究发现，APOE 调节Aβ 的清除主要是将大脑中Aβ 通过血脑屏障运输到外周血液循环，而APOE4对Aβ 的运输能力和清除效率显著低于APOE3，可能与APOE4-脂蛋白与Aβ 的亲和力低于APOE3-脂蛋白相关［15］。此外，APOE 亚型对大脑胆固醇水平的调节不同，而胆固醇可调节γ-分泌酶活性和Aβ的产生，相比于APOE4，APOE3 可更有效的促进酶介导的Aβ 降解［16］。最近，许多研究发现，APOE 等位基因亚型可影响大脑及脑脊液中APOE 的水平(ε4＜ε3＜ε2)，认为APOE ε4 基因携带者所引起的总APOE 水平的降低可能有助于AD 疾病的进展［17］。此外，APOE 还与AD 其他的风险因子密切相关，已经证实，APOE ε4 可通过与动脉粥样硬化，周围血管疾病及2 型糖尿病等协同作用增加AD 的发病风险。最近，Yang 等［18］亦证实，APOE 与成人海马齿状回区域的神经干细胞或祖细胞的维护密切相关，而APOE ε4 可通过损伤海马区γ-氨基丁酸(GABA)能中间神经元抑制海马神经发生，从而导致记忆和学习障碍，揭示APOE4 的一个重要病理作用，即通过抑制或减少神经发生促进AD 疾病的进展［2］。已经证实，APOE 的表达受核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)和肝脏X 受体(liver X receptors)与维甲酸X 受体(retinoid X receptors，RXRs)协调作用影响。Cramer 等［19］证实，在患有AD 的啮齿类动物中，口服RXRs 激动剂蓓萨罗丁(bexarotene)可提高APOE 的表达，并显著增强APOE 基因依赖的Aβ 的清除，其72 h 内可将小鼠脑内沉积的Aβ 清除半数，最终的总清除率可达75%，提示将APOE 作为AD 检测和治疗靶点的具有广阔前景。免疫治疗作为AD 的治疗策略亦取得一定成果，如近期靶向于Aβ N 末端的抗体bapineuzumab，其III 期临床试验结果显示，bapineuzumab 可有效阻止携带APOE ε4 基因的轻中度AD 患者大脑Aβ 的沉积，较低其微管相关蛋白tau 的磷酸化水平。此外，Head 等［20］研究表明，维持血管健康，积极的休闲活动和锻炼有助于减少APOE ε4 基因携带者AD 的发生和认知功能下降。近年来，APOE ε4 作为AD发病的风险因子正逐渐成为探索AD 发病机制的热点，然而基于AD 发病机制的关系仍有许多不清，尚需要大量APOE ε4 相关的研究探索工作。由于APOE 对AD 的作用还可能受LDLR 基因及胆固醇水平等因素调节，单纯的以APOE ε4 等位基因预测AD 仍存在一些局限。如Itabashi 等［21］研究发现，仅通过APOE ε4 诊断AD 的敏感度和特异度不高(50%左右)，且存在一定程度的假阳性和假阴性。因此，应该指出，单独应用APOE ε4 作为AD 诊断的生物标记物时，应首先排除影响其检测的因素，亦或结合其他生物标记物联合诊断，以提高其在AD 早期诊断的灵敏度和特异度。

近期大量研究发现，在早期AD 患者的脑脊液和尿液中阿尔茨海默相关神经丝蛋白(alzheimer’s disease related neural thread protein，AD7c-NTP)的表达水平都选择性的增加。AD7c-NTP 属神经丝蛋白家族的一个成员，是由375 个氨基酸组成的基因序列编码产生大小为41KD 的跨膜磷酸化蛋白，大量存在于AD 患者脑中的NFTs 中，参与脑神经元的修补、再生和凋亡等［22］。AD7c-NTP 主要在组织学尚完整的变性神经元中表达增加，待神经元细胞衰亡后，大量的AD7c-NTP 被释放到脑脊液中，后经尿液排出。de la Monte 等［23］发现，在AD 病程的早期AD7c-NTP 基因过度表达，从而引起AD7c-NTP 免疫活性的增强，进而导致磷酸化tau 蛋白免疫介导的细胞骨架病变，但AD7c-NTP 不参与淀粉样蛋白的聚积。另外，过度表达的AD7c-NTP 还可加速凋亡介导的神经细胞死亡，促进p53 和CD95 等促凋亡基因的表达，还可引起线粒体功能受损等［24］。越来越多的证据表明，AD7c-NTP 的异常变化是AD 病程早期的生物学事件，其在脑脊液和尿液中的含量与AD疾病的严重程度呈正相关［25］。若脑脊液或尿液中含量异常增高，早期可疑或可能AD 占62%，死后确定诊断的AD 占84%。然而，有对脑脊液中AD7c-NTP 进行检测有损伤大脑的风险，且需专业人员及特殊设备，使其在应用时存在一定的局限性。近期，大量的研究表明，AD 患者尿液中AD7c-NTP 的水平较正常老人显著增加，与年龄无关。尿AD7c-NTP诊断早期AD 的特异度为90%，灵敏度为80%～85%，与脑脊液标本的检测相比具有取材简单、无创、易复查等特点，使其在AD 早期诊断上更具应用价值［26］。

本研究结果显示，PAD 组患者APOE ε4 等位基因表达频率较对照组显著升高(见表1)，说明AD 发病与APOEε4 等位基因的水平相关，然而单独应用APOE ε4 作为AD 早期诊断的生物标记物，其灵敏度和特异性仅50%左右(见表1)，提示APOE ε4 仅适于作为AD 易发人群早期基因筛查，应同时结合临床病理检查和/或特异的AD 生物标记物等进一步诊断及监测。与Tan 等研究结果一致，我们的结果显示，尿AD7c-NTP 水平在PAD 组患者中显著高于对照组，其灵敏度为81.25，特异性高达86.67%。为评估APOE ε4 与AD7c-NTP 联合检测在AD 易发人群早期筛查和诊断中临床意义，我们对APOE ε4和AD7c-NTP 联合检测进行比较，结果显示，联合检测的灵敏度、特异性、PPV 和阴NPV 均高于单独检测。此外APOE ε4 和AD7c-NTP 检测操作简单，无创，可重复性高，易于患者定期监测，提示APOE ε4与AD7c-NTP 联合检测在AD 早期诊断中具有较好的应用价值。

总之，我们的研究结果证实，在疑似AD 患者中，APOE ε4 等位基因的表达频率显著增高，而尿AD7c-NTP 的水平亦显著升高，二者的变化与AD 疾病早期进展关系密切。通过APOE ε4 与AD7c-NTP联合检测可互补二者在单独应用时的不足，提升AD诊断的预测价值，宜作为AD 易发人群筛查及早期诊断的生物标记物。

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