白藜芦醇对乳腺癌患者基质金属蛋白酶9活性的影响

方勇 魏付桥

乳腺癌是女性死亡的第二大死因。尽管其机制尚未阐明，但癌细胞与细胞外基质黏附能力的改变是转移发生的前提[1]。在这一过程中肿瘤细胞表达和分泌一些蛋白酶如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）分解组织中的基质，从而促进肿瘤的增生与转移[2-3]。在众多的MMPs中，其中MMP-9和MMP-2在降解IV型胶原中发挥重要作用[4]。白藜芦醇是广泛存在于各类植物中的一种天然多酚，研究显示其具有多重药理作用，包括心肌保护，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒张等[5]。此外，白藜芦醇也能通过多种机制调节肿瘤细胞的增殖，侵袭以及凋亡，因此是一种潜在的高效肿瘤预防药物[6]。本研究旨在观察白藜芦醇是否能影响乳腺癌细胞系MCF-7细胞MMP-9的表达，并观察其抑制效应是否与NF-κB有关。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 白藜芦醇和明胶购自购自Sigma-Aldrich公司，抗p 65、PCNA、β-actin抗体购自Santa Cruz。其他分析纯产品分别来源于上海生工和AMERCO。Transwell chamber和Matrigel分别购自Costar和Sigma。

1.2 MCF-7细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7用含10%牛胎儿血清、100 U/mL的青霉素以及100 U/mL的链霉素的DMEM培养基（pH 7.4）中在37℃、5% CO2条件下培养。实验分为阴性对照组和白藜芦醇处理组 。其中阴性对照组加入等体积培养基，而处理组加入不同浓度的白藜芦醇在37℃下处理实验细胞24～72 h。

1.3 Transwell小室检测MCF-7细胞迁移与侵袭 制备密度为2×106/mL的细胞悬液并加入至Transwell上室。下室加入0.6 mL含20% FBS的培养基及不同浓度的白藜芦醇。培养结束后取出Transwell小室，计算膜下细胞数。侵袭实验与迁移类似，不同之处是在Transwell滤膜上铺上Matrigel。细胞侵袭指数=处理组穿膜细胞数/对照组细胞数。

1.4 明胶酶谱实验 细胞用无血清培养基培养24 h后，收集上清，加入含1 mg/mL明胶的SDS-PAGE（分离胶10%）。加入含2.5% Triton-X-100复性液孵育30 min以去除SDS。随后将凝胶用50mmol/L HCl（pH 7.4），5mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育过夜。加入0.05%考马斯亮蓝R-250室温染色30 min，去离子水脱色，拍照，灰度扫描。

1.5 瞬时转染和荧光素酶报告基因分析 采用pMMP-9-Luc，pNF-κB-Luc报告质粒分析MMP-9和NF-κB转录活性。当MCF-7细胞融合度应达到70%～80%时，共转入0.2μgmmP-9或NF-κB报告基因质粒以及0.2μg pSV-β-半乳糖苷酶并培养24 h。根据试剂盒（Promega）操作步骤，采用光测定仪获取萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。裂解细胞后，获取3次实验的平均值，以β-半乳糖苷酶活性为内参照，得到标化的萤光素酶活性。

1.6 统计学方法 采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对MCF-7迁移和侵袭的影响 MCF-7细胞与12.5～100 μmol/L白藜芦醇孵育24 h后，其迁移率和侵袭力随着浓度的增加而降低。当白藜芦醇浓度为50 μmol/L时，其迁移与侵袭率分别降低了34%和30%（见图1）。

2.2 白藜芦醇对MCF-7细胞MMP-9活性的影响 明胶酶谱实验显示，12.5～100 μmol/L白藜芦醇孵育24 h后，MMP-9活性随着浓度的增高而降低，其中白藜芦醇为100 μmol/L时，其活性降低了 56%（见图2）。

图1 白藜芦醇对MCF-7细胞侵袭和迁移的影响

图2 白藜芦醇对MCF-7细胞内MMP-9酶活性的影响

图3 白藜芦醇经抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9转录

2.3 白藜芦醇通过抑制PMA诱导的NF-κB活性而抑制MMP-9的转录

报告基因结果显示，白藜芦醇能以剂量依赖性方式抑制MMP-9的启动子的活性，而NF-κB缺失突变株（-580/+13和-450/+13）启动子活性轻微受影响（见图3）。

3 讨论

目前临床用于肿瘤预防与化疗的药物当中，70%来自天然植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，大量存在于红葡萄酒中。此外，花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。白藜芦醇的实验研究已经证实具有对心血管疾病和癌症的有益作用[7]。 白藜芦醇对激素依赖性肿瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等）有明显的预防作用[6-8]，但并没有相关的系统性研究方面的报道。因此，白藜芦醇确切的抗肿瘤分子机制依然有待进一步研究。在本研究中，我们对白藜芦醇对MCF-7细胞增殖进行了探讨，结果证实：（1）白藜芦醇能抑制MMP-9的表达与活性；（2）白藜芦醇能抑制NF-κB的激活从而抑制NF-κB介导的MMP-9的表达而抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。MMP-9基因转录收上游启动序列的调控，如AP-1、NF-κB以及SP-1等。我们采用突变的报告质粒对MMP-9启动子活性进行了探讨。当NF-κB结合位点突变后，白藜芦醇对MMP-9的抑制效应消失。这表明NF-κB参与了MMP-9的转录过程。而白藜芦醇通过抑制NF-κB p 65亚基的核转位，最终抑制MMP-9的表达及酶活性，从而最终抑制MCF-7细胞的转移。

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