IL-17A 基因rs8193037 和rs1974226 位点多态性与重症肌无力的相关性研究

王 琦 ，岳耀先，洪 宇，谢琰臣，郝洪军 张贤军，谷传凯，高 翔，张 栩，李海峰

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是主要由乙酰胆碱受体(AChR)抗体介导细胞免疫及体液免疫系统共同参与的自身免疫疾病。实验性变态反应性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)研究发现Th17 细胞参与MG 发病［1］。IL-17A 是Th17 细胞产生的细胞因子，其基因位于人类第6 号染色体上。已有研究证实IL-17A 的浓度与EAMG 的肌无力严重程度有关［2］;伴胸腺瘤的MG 患者血清IL-17A 及其mRNA 水平也显著高于健康对照组［3］。

本研究通过对 MG 患者的 IL-17A 基因rs8193037 及rs1974226 位点进行分型，探索其与MG 易感性和严重程度的相关性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 纳入2007 年11 月～2013 年6 月在青岛大学医学院附属医院及北京友谊医院诊治随访的MG 患者480 例，患者间无亲缘关系，符合MG 的诊断标准［4］。对照组随机选取同地区健康查体人员487 例，均为中国北方汉族人口，与患者无亲缘关系，排除慢性感染性疾病及自身免疫疾病。本研究获得各自医院的伦理委员会同意，纳入的MG患者均知情同意。纳入的患者每年至少随访两次，并在病情加重时及调整治疗后2～3 个月内均有随访。MG 组按发病年龄［5］、合并胸腺瘤与否(胸腺CT 及/或胸腺病理证实)、AChR 抗体、首发受累范围(眼肌型/全身型)、发病后两年间最重受累范围及最重时严重程度(Oosterhuis 评分)［6］，分成亚组。自然史研究发现82%的MG 患者发病2 y 内发展到疾病最严重程度［7］，故我们对病程2 y 以上且资料充分者，分析其最重时的受累范围和Oosterhuis 评分。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 选取位于6 号染色体5’端启动子调节区的rs8193037 位点及3’端转录非翻译区的rs1974226 位点［8，9］，两位点在中国人群中最小等位基因频率(MAF)均≥0.05(Hapmap，CHB 数据库)。采用上海天昊生物科技有限公司SNPscanTM技术进行基因分型［10］。随机选取4%的样本进行双盲质控，质控结果与原分型结果一致。

1.2.2 统计方法 采用χ2检验或Fisher 精确检验比较MG 组与对照组、各MG 亚组与对照组及MG 亚组间等位基因频率的差异(SPSS17.0 软件，P＜0.05 认为差异有统计学意义)。使用在线软件SNPstats 进行对照组的Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，在共显性与加性遗传模型下比较MG 组与对照组、各MG 亚组与对照组以及MG 亚组间基因型频率的差异，并使用SNPstats 内置的Logistic 回归程序在共显性与加性遗传模型下带入性别、发病年龄、胸腺情况、AChR 抗体和首发受累范围等因素进行校正。使用Haploview 4.2 软件进行连锁不平衡分析。使用PGA 软件(http://dceg.cancer.gov/tools/analysis/pga)计算统计效力。

2 结果

2.1 MG 组与对照组一般资料 480 例MG 患者中男189 例，女291 例;发病年龄1～86 岁(中位数40 岁，四分位间距32 岁)，＜15 岁者71 例，15～50 岁者253 例，＞50 岁者156 例;胸腺瘤者107 例，不伴胸腺瘤者367 例，无资料者6 例;AChR 抗体阳性者338 例，阴性者124 例，无资料者18 例。发病时为眼肌型者342 例，全身型者135 例，无资料者3例。MG 组患者总病程8～220 个月(中位数43 个月，四分位间距61 个月)，每年平均随访6.5 次。有发病后2 y 间最严重时受累范围资料者425 例，眼肌型151 例，全身型274 例;有发病后2 y 间最严重时Oosterhuis 评分资料者370 例，0～2 分者216 例，3～5 分者154 例。对照组共487 例，其中男249 例，女238 例，年龄14～78 岁(中位数45 岁，四分位间距24 岁)。rs8193037 及rs1974226 位点分型成功率分别为98.55%和99.17%。对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡。

2.2 MG 整组及亚组与对照组比较 MG 整组与对照组两位点的等位基因频率和共显性及加性模型下的基因型频率均无显著性差异(P ＞0.05，见表1)。亚组比较:rs8193037 位点的等位基因频率和共显性及加性模型下的基因型频率在根据发病年龄、胸腺情况、抗体、首发受累范围、2 y 间最重受累范围和最重时Oosterhuis 评分划分的各亚组间及各亚组与对照组比较均无显著性差异。rs1974226 位点15～50 岁亚组T 等位基因频率显著低于＞50 岁亚组(P=0.007，OR=0.411，95% CI 0.217～0.778)，基因型频率在共显性及加性模型下有显著差异(P=0.016 和P=0.0054)，采用logistic 回归在共显性及加性模型下校正性别、胸腺情况、抗体和首发受累范围等特征后仍有统计学差异(P=0.023 及P=0.0089)。＜15 岁亚组与15～50 岁和＞50 岁亚组的比较以及各年龄亚组与对照组的比较，等位基因和基因型频率均无显著性差异(P ＞0.05，见表2)。在等位基因频率比较实际获得的OR 值为0.411 且显著性水平为0.05 时，15～50 岁和＞50 岁亚组比较的统计效力为44%。rs8193037 位点的等位基因频率和共显性及加性模型下的基因型频率在其余亚组间及各亚组与对照组间均无显著性差异(P ＞0.05，见表2)。

2.3 连锁不平衡分析 MG 组与对照组总体，rs8193037 与rs1974226 的连锁不平衡参数D’=0.79，r2=0.07，提示两位点连锁不平衡程度较低。

表1 rs8193037 及rs1974226 位点与MG 整组相关性分析

表2 rs8193037 及rs1974226 位点与MG 亚组相关性分析［例数(%)］

3 讨论

Th17 细胞是一类独立的CD4+T 细胞亚群，主要分泌细胞因子IL-17A，参与自身免疫反应、过敏反应、肿瘤免疫以及对抗细菌和真菌感染的宿主防御反应［11］。Th17 细胞在MG 的研究起源于干扰素γ缺陷鼠仍可发生EAMG 的报道［1］。Wang 等［2］进一步发现IL-17A 水平与EAMG 动物的肌无力严重程度相关。已有研究证实IL-17A 基因多态性与中国人群炎症性肠病［7］及自身免疫性甲状腺炎［8］相关，但IL-17A 基因多态性与MG 的易感性和严重程度的关系尚无报道。本研究选取的 rs8193037 及rs1974226 位点分别位于人类6 号染色体5’端启动子调节区及3’端转录非翻译区。启动子能够控制基因转录和表达的起始和程度，而转录非翻译区影响mRNA 的剪切和稳定性，两个位点发生变异可能会影响IL-17A 基因的转录，进而影响IL-17A 的浓度和功能。本研究的分型成功率＞98.5%，对照组中两位点的基因型和等位基因分布均符合Hardy-wenberg 平衡。两位点基因型频率与Pubmed 基因数据库中中国汉族人群的数据相近。两位点连锁不平衡程度低，也与Hapmap 数据库数据一致。我们对性别、发病年龄、胸腺情况、AChR 抗体和首发受累范围的亚组分析有助于支持MG 整组易感性分析的可靠性并探索关联性更高的临床特征;而2 y 间受累范围和最重时Oosterhuis 评分亚组在一定程度上反映了MG 的严重程度。

rs8193037 位点的等位基因频率和共显性及加性模型下的基因型频率在MG 整组、各亚组与对照组比较以及各亚组之间比较均无显著性差异，提示该位点的多态性与MG 的易感性和严重程度无关。而rs1974226 位点的等位基因频率和共显性及加性模型下的基因型频率在MG 整组与对照组无显著性差异，仅两个年龄亚组比较等位基因和基因型频率有统计学差异，其余各亚组与对照组比较以及各亚组间比较均无显著性差异。针对显著性差异的亚组，采用logistic 回归对潜在的混杂因素(性别、发病年龄、胸腺情况、AChR 抗体、首发受累范围)进行校正发现仍有统计学差异，但仅局限在这两个年龄亚组之间。但这两个亚组等位基因差异的统计效力仅有44%，故认为该差异可能因亚组分析样本量不足所致，且整组中无统计学差异，故不认为rs1974226位点与MG 的易感性和严重程度有关。

Mu 等［12］报道EAMG 存在Th1、Th2、Treg 及Th17 细胞比例的失调。Th17 细胞及IL-17A 在病程早期(致敏后14 d)水平变化不大，但病程晚期(致敏后42 d)显著增高，且IL-17 对AChR 特异性T 细胞和分泌抗AChR 抗体的B 细胞的促进作用仅见于病程晚期，提示IL-17A 在MG 发病后维持和加强AChR 特异性免疫反应，从而影响MG 的严重程度。陆珺等［13］比较了93 例MG 患者与34 例健康对照者血清IL-17A 水平，未发现显著性差异。Roche 等［14］报道全身型MG 患者血清IL-17A 水平高于健康对照，但主要由2 例伴胸腺异常者所致，眼肌型MG 患者与对照并无显著性差异。我们对69 例未治疗的MG 患者的研究发现血清IL-17A 水平与反映严重程度的QMG 评分正相关，但此研究中QMG 评分反映的严重程度为采集标本时的严重程度，与本研究中病程2 y 间最重严重程度不同。

综上所述，本研究未发现IL-17A 基因rs8193037及rs1974226 位点基因多态性与MG 的易感性和严重程度有关。本研究的结果还需要其他独立样本的研究或汇总分析来进一步验证。IL-17A 在MG 发病机制中的作用还需要结合MG 表型以及IL-17A 的遗传学、免疫学和动物实验研究来进一步阐释。

［1］Zhang GX，Xiao BG，Bai XF，et al.Mice with IFN-gamma receptor deficiency are less susceptible to experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.J Immunol，1999，162(7):3775 -3781.

［2］Wang W，Milani M，Ostlie N，et al.C57BL/6 mice genetically deficient in IL-12/IL-23 and IFN-gamma are susceptible to experimental autoimmune myasthenia gravis，suggesting a pathogenic role of non-Th1 cells［J］.J Immunol，2007，178(11):7072 -7080.

［3］王中魁，王 卫，陈玉萍，等.重症肌无力胸腺瘤Th17 细胞及细胞因子变化［J］.中华内科杂志，2012，51(7):540 -542.

［4］王梓炫，李海峰，孙 亮，等.散发性重症肌无力患者267 例维生素D 受体基因多态性［J］.中华神经科杂志，2011，44(7):473-478.

［5］Aarli JA.Myasthenia gravis in the elderly:Is it different［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2008，1132(1):238-243.

［6］Skeie GO，Pandey JP，Aarli JA，et al.TNFA and TNFB polymorphisms in myasthenia gravis［J］.Arch Neurol，1999，56(4):457-461.

［7］Grob D，Brunner N，Namba T，et al.Life time course of myasthenia gravis［J］.Muscle Nerve，2008，37(2):141 -149.

［8］Zhang X，Yu P，Wang Y，et al.Genetic polymorphisms of interleukin 17A and interleukin 17F and their association with inflammatory bowel disease in a Chinese Han population［J］.Inflamm Res，2013，62(8):743-750.

［9］Yan N，Yu YL，Yang J，et al.Association of interleukin-17A and -17F gene single-nucleotide polymorphisms with autoimmune thyroid diseases［J］.Autoimmunity，2012，45(7):533 -539.

［10］唐天萍，洪 宇，谢琰臣，等.补体C3 基因rs7951 位点多态性与重症肌无力的相关性研究［J］.中风与神经疾病杂志，2013，30(4):320 -324.

［11］Iwakura Y，Ishigame H，Saijo S，et al.Functional specialization of interleukin-17 family members［J］.Immunity，2011，34(2):149-162.

［12］Mu L，Sun B，Kong Q，et al.Disequilibrium of T helper type 1，2 and 17 cells and regulatory T cells during the development of experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Immunology，2009，128(12):826-836.

［13］陆 珺，黄 莹，卢家红，等.重症肌无力患者血清Th1/Th2/Th17 细胞因子的变化及意义［J］.中国临床神经科学，2010，18(5):480 -484.

［14］Roche JC，Capablo JL，Larrad L，et al.Increased serum interleukin-17 levels in patients with myasthenia gravis［J］.Muscle Nerve，2011，44(2):278 -280.