氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型内的代谢动力学*

赵青松 金 珊 陈寅儿 秦方锦 王锡波 王国良

(宁波大学海洋学院 宁波 315211)

氟苯尼考(florfenicol)属于酰胺醇类抗生素,为广谱抑菌剂,对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及支原体等有抑制作用,是我国当前畜禽和水产养殖业中应用较为广泛的抗菌药物之一(Samuelsenet al,1998;Stefanet al, 2004;徐力文等,2005;杨倩等,2010;黄绪玲等,2011;杨红初等,2012)。近年来,国内外已有氟苯尼考在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋鲑(Salmo salar)、西伯利亚鲟(Acipenser baeri)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)、鲇鱼(Silurus asotus)、异育银鲫(Crucian carp)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)等多种水产动物体内的代谢动力学及组织分布的报道(李静云等,2004;Parket al,2006;杨倩等,2010;黄绪玲等,2011;王瑞雪等,2012) ,但至今未见其在蟹类体内代谢过程的有关资料。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是中国海水养殖的主导品种之一,也是浙江省水产养殖的主要品种。但由于高密度养殖,使得疾病频发,特别是由弧菌属细菌引起的疾病,发病率一直居高不下(林克文,2002;王国良等,2006)。目前水产弧菌性疾病的防治仍是以药物为主,而渔业用药大都参考畜禽或健康水产动物的药动学数据,这与生产实际情况存在较大差异。因此,为探明疾病对氟苯尼考在三疣梭子蟹体内代谢规律的影响,本研究在构建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基础上(张樱等,2010),比较研究了健康和疾病条件下氟苯尼考在三疣梭子蟹体内的代谢动力学及组织分布,以期为三疣梭子蟹合理用药和休药期的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

三疣梭子蟹(P.trituberculatus)购于宁波庄市梭子蟹暂养场,体质量(90±25)g,共 220只,购回后于实验室暂养,养殖用水采用海水晶配置,盐度25±1,水温(21±2)°C,pH 8.0±0.5。确定待检测蟹各组织没有药物残留后,挑选活泼健康个体进行实验。实验时间为15d,实验期间连续充气,每日换水50%,不投饵。

1.2 药品及试剂

抗凝剂(柠檬酸钠 8g/L,葡萄糖 20g/L,EDTA 3.36g/L,吐温 80 100μL/L);氟苯尼考原料药(含量10%,河南大明实业有限公司);氟苯尼考标准品(含量99.2%,中国兽医药品监察所)。

1.3 主要仪器

Agilent Technologies1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),包括G1311A四元泵、G1314B紫外检测器、G1311A柱温箱、Chemstation色谱工作站、G1329A自动进样装置等;R206D旋转蒸发仪。

1.4 溶藻弧菌疾病模型的构建

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)由宁波大学海洋学院水产病害研究室提供。三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型采用张樱等(2010)方法构建。

1.5 给药及采样(余开等,2011)

以 25mg/kg剂量的氟苯尼考水溶剂分别对健康和患病三疣梭子蟹口灌给药,无回吐个体用于实验。在给药后 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、168、240h采集血淋巴、肝胰腺和肌肉样品。血淋巴与抗凝剂 1︰1混均后,4°C离心10min(3000r/min),收集上层血浆;肝胰腺和肌肉分装于样品袋中,所有样品保存在–20°C冰箱。每个时间点各取5只蟹,实验前取健康蟹组织做对照。

1.6 样品前处理

自然解冻样品后,准确取0.5mL血浆、0.5g经高速均质的肌肉和肝胰腺组织匀浆,加入 4mL的乙酸乙脂,在漩涡振荡器上旋涡混匀 5min,4°C离心10min(6000r/min),取上层提取液至20mL离心管中。同法重复提取一次,合并两次提取液,旋转蒸发仪中45°C水浴蒸干后,加入1mL流动相,涡旋振荡2min溶解残存物,用0.45μm有机针头滤器过滤,–20°C保存于样品瓶中,高效液相色谱仪(HPLC)待测。其中,组织样品提取液中加入适量正己烷用于溶解脂肪。

1.7 色谱条件

色谱柱:Diaimonsil TM–C18柱(150mm×16mm i.d.,填料粒度5μm);流动相:乙腈︰蒸馏水= 27:73(v/v),使用前用0.45μm微孔滤膜真空抽滤并超声脱气;流速:1.0mL/min;紫外检测波长:223nm;柱温:30°C;pH 7.0;进样量:20μL。

1.8 标准曲线及检测限

采用外标法测定。用流动相把氟苯尼考标准品配制成 100μg/mL储备液,于–20°C避光保存。实验时将储备液稀释成10、5、2、1、0.5、0.05μg/mL的标准工作液进行HPLC测定。以峰面积为纵坐标,药物质量浓度为横坐标制作标准曲线,求出回归方程和相关系数后,按信噪比 S/N=2计算最低检测限(LOD)。

1.9 回收率和精密度

采用加样回收法。在适量的空白肌肉、血浆和肝胰腺中分别加入氟苯尼考储备液并稀释成0.5、1、5μg/mL(μg/g)系列理论浓度,按1.6方法进行提取和测定,每个浓度重复3次。相对回收率(%)=样品实测浓度/样品理论浓度×100%。将以上3个组织空白样品的3个浓度于1d内的3个不同时间点重复进行测试,并连续测定3d,计算各组织中氟苯尼考的日内平均变异系数和日间平均变异系数。

1.10 数据处理

标准曲线回归方程采用Microsoft Excel 2003软件分析;药时数据用3P97药动学软件处理。

2 结果

2.1 标准曲线及检测限

氟苯尼考的标准溶液在0.05—10μg/mL质量浓度(X)之间与平均峰面积(Y)具有良好的相关性,线性回归方程为Y＝32.51X+0.79,相关系数R2＝1。按信噪比S/N=2计算,本方法最低的检测限是0.025μg/mL。

2.2 回收率与变异系数

氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血浆三种组织中的回收率分别为(84.8±1.6)%、(88.0±8.9)%、(94.2±2.0)%,均大于80%;而在肝胰腺、肌肉、血浆三种组织中的日内变异系数分别为2.63、2.18、2.54,日间变异系数分别为3.67、3.23、4.61,均小于5%,说明用本实验方法检测氟苯尼考,回收率高而稳定。

2.3 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三种组织中的浓度-时间变化

氟苯尼考在健康和患病蟹肝胰腺、肌肉和血浆三种组织中的药时曲线见图1—3。结果表明,氟苯尼考在健康和患病蟹相同组织中的代谢规律相似,给药0.25h时,两组蟹三种组织中均可检测到药物的存在,且在肝胰腺中已达峰值,分别为6.85μg/g和3.32μg/g;随后肝胰腺中的药物浓度均显著下降,实验 2h时分别已降至峰值的 15.16%和 33.21%;此后肝胰腺中的药物浓度保持在一定水平,至实验 12h时分别出现第二个药峰,健康组为 3.23μg/g,患病组为1.64μg/g。而肌肉和血浆中的药物吸收和消除情况与肝胰腺明显不同,实验开始后药物浓度逐渐上升,健康组肌肉和血浆均于实验 2h时达峰,而患病组肌肉和血浆分别于实验2h和4h达峰,其后逐渐下降。实验24h后,各组织药物消除速率均趋缓,健康组和患病组分别在实验168h和240h时药物浓度基本维持在0.1μg/mL以下,98.6%以上的药物被代谢、转移或排泄出机体。

图1 氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺中的药时曲线Fig.1 Change of florfenicol concentration with time in hepatopancreas of P.trituberculatus

图2 氟苯尼考在三疣梭子蟹肌肉中的药时曲线Fig.2 Change of florfenicol concentration with time in muscle of P.trituberculatus

图3 氟苯尼考在三疣梭子蟹血浆中的药时曲线Fig.3 Change of florfenicol concentration with time in plasma of P.trituberculatus

2.4 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三种组织中的药动学特征

健康和患病蟹三种组织中的药时数据经3P97药动学软件分析后显示,氟苯尼考在三种组织中的代谢规律均可用带时滞的一级吸收二室开放模型来描述。药动学方程和参数分别见表1和表2。与健康组相比,患病蟹肝胰腺药物消除半衰期(T1/2β)、总体清除率(CLs)、表观分布容积(Vd),肌肉药物吸收半衰期(T1/2Ka)、达峰时间(Tpeak)、药峰浓度(Cmax)、CLs、Vd,血浆药物吸收速率常数Ka、T1/2Ka、T1/2β、Tpeak、Vd等药动学参数均发生了显著的变化(P＜0.05);而肝胰腺 Ka、T1/2Ka、Tpeak、Cmax、药时曲线下总面积 AUC,肌肉Ka、T1/2β、AUC,血浆AUC、CLs等药动学参数均发生了极显著的变化(P＜0.01)。

表1 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹组织内的药动学方程Tab.1 Equations of florfenicol concentration with time in healthy and diseased P.trituberculatus

表2 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹体内的药动学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of florfenicol in healthy and diseased P.trituberculatus

3 讨论

氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血浆三种组织中的药时曲线和药动学数据显示,健康和患病三疣梭子蟹三种组织对氟苯尼考的渗透性良好,吸收迅速;给药后 0.25h三种组织中都已检测到氟苯尼考,但以肝胰腺药物浓度达峰最快并有二峰现象,肌肉次之,血浆最晚。这一现象与畜禽(蒋红霞,2001;胡顶飞等,2002;刘帅帅等,2012)及鱼类(Parket al,2006;王伟利等,2010;林茂等,2011;王瑞雪等,2012;葛建,2012)等的药物代谢特征不同,但与余开等(2011)、唐俊等(2006)等研究的药物在三疣梭子蟹和中华绒螯蟹体内的代谢及郑重莺等(2007)研究氟苯尼考在南美白对虾体内的代谢特征类同。由于蟹类的消化系统构造与鱼类等略有不同,其胃内有肝孔与肝胰腺相通,肝胰腺可以很快对药物进行吸收、代谢转化并向血淋巴、肌肉等组织转移,而由于肠道也可吸收部分药物,且蟹为开管式循环系统,因此造成了血淋巴药物浓度达峰稍晚,肝胰腺药物浓度出现二峰的现象(余开等,2011;唐俊等,2006)。

据报道,疾病会造成动物机体细胞、组织、器官的形态改变和生理功能障碍,从而影响药物在动物体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程(Baggot,1980)。Uno(1996)研究表明土霉素在患弧菌病香鱼体内的生物利用度会显著下降;刘彦等(2006)和余开等(2011)分别在牙鲆和梭子蟹对药物的代谢研究中发现,细菌感染会导致药物在机体主要组织中的代谢规律明显改变,药物的吸收、分布和消除减慢;此外,其他学者在研究山羊(刘涤洁等,2003)、鸡(张秀英,2001;黄显会等,2003)、猪(曾振灵等,1996)等动物对药物的代谢时也证实,患病情况下动物对药物的吸收速度明显减慢,吸收量下降,消除延缓。本实验结果显示,氟苯尼考在健康蟹和患病蟹相同组织中的药时曲线形态相似,代谢过程均可用带时滞的一级吸收二室开放模型来描述,这与刘彦等(2006)和黄显会等(2003)的研究结论基本一致。与健康蟹相比,患病蟹三种组织对氟苯尼考的吸收速度和吸收率明显下降,半衰期显著延长,清除率显著下降,药时曲线下总面积和表观分布容积变大,说明弧菌感染已对三疣梭子蟹主要组织器官造成了损害,特别是肝胰腺发生了功能性障碍,肝代谢转化酶活性下降,药物不可逆消除减慢。此外,本实验中感染蟹Vd的增大,也说明病理状态能降低药物与血浆蛋白的结合率,使其在组织中分布更加广泛,有利于疾病的治疗(苏成业,2003)。若以国家动物性食品中氟苯尼考最高残留限量 0.1mg/kg为标准,从图1—3可看出,健康蟹和感染蟹给药后分别需168h和240h,三种组织中的氟苯尼考含量才会下降到0.1mg/kg以下,因此,建议三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休药期应在10d以上。

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