齐墩果酸对氧化损伤模型人脐静脉内皮细胞的保护作用Δ

王巧云，李丙华，朱 莉，李 萍，韩志武#（1.青岛大学药学院，山东青岛 66071；.青岛市第八人民医院药剂科，山东青岛 66100；.青岛大学附属医院药学部，山东青岛 6600）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）发生于全身动脉系统，近年来其发病率日益上升[1]。Ross提出AS是一种炎症性疾病，探讨药物对内皮细胞炎症反应的影响，成为国内外AS研究的热点[2]。

齐墩果酸（Oleanic acid）是一种从天然产物中提取的五环三萜类化合物[3]。近十年来，齐墩果酸对心血管疾病的保护作用引起了国内外学者的关注。Somova LI[4]等发现齐墩果酸具有抗AS的作用。Sultana N[5]报道了齐墩果酸的心血管保护作用，与其自身所具有不饱和基团清除活性氧、提高抗氧化酶的活性有关。但是，齐墩果酸抗AS的具体机制仍有待探索。

血管内皮细胞的氧化损伤，尤其是低密度脂蛋白氧化修饰生成的氧化性低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是诱发血管内皮细胞炎症反应的主要因素[6]，是AS预防和治疗的关键靶点。本研究通过复制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤模型，探讨齐墩果酸对HUVECs的保护作用，并进一步对其机制进行研究。

1 材料

1.1 仪器

680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；723型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；IX50型倒置显微镜（日本Olympus公司）；TDL-50B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

齐墩果酸（美国Sigma公司，批号：05504，纯度：99%）；人胆囊收缩素（CCK-8，日本同仁化学研究所，批号：C0038）；ox-LDL（广州奕源生物科技有限公司，批号：YB-002-1）；维生素E（美国Sigma公司，批号：S20796-254）；过氧化氢酶（CAT）测试盒（批号：20140227）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒（批号：20140220）、一氧化氮（NO）测试盒（批号：20140227）、总一氧化氮合酶（NOS）测试盒（批号：20140220）均购于南京建成生物工程研究院。

1.3 细胞

HUVECs（中国科学院上海细胞库）。

2 方法

2.1 细胞培养

将生长状态良好的传代HUVECs加入胰蛋白酶消化1 min，吹打下细胞悬液离心后弃上清液，再加入适量含有10%灭活胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素的DMEM高糖培养基，置37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

2.2 复制模型细胞ox-LDL最适质量浓度的筛选

每孔分别加入终质量浓度含0（即对照组）、25、50、100、200、400 µg/ml ox-LDL的10%胎牛血清DMEM培养基孵育HUVECs 24 h后，每孔加入10µl CCK-8，继续培养2 h后，用酶标仪在450 nm波长处检测光密度（OD）为细胞活性，按下式计算细胞存活率，重复3次。另设仅有培养液的为空白对照组。细胞存活率（%）＝（试验组OD450－空白对照组OD450）/（对照组OD450－空白对照组OD450）×100%。

2.3 齐墩果酸最适浓度的筛选

精密称取齐墩果酸0.022 8 g，溶于1 ml DMSO中制备50 mmol/L贮备液，－20 ℃贮藏，备用，试验时用DMEM高糖培养基将贮备液稀释；取HUVECs（细胞密度为1.5×108L－1），按每孔100 µl细胞加入96孔板，分别加入浓度为0、10、20、40、60、80、100µmol/L的齐墩果酸，每组6孔，培养24 h后，按“2.2”项下方法以CCK-8法检测并计算细胞存活率。

2.4 齐墩果酸对模型细胞的保护作用

试验随机均分为7组，即正常对照（正常培养液）组、模型（正常培养液）组、维生素E（200µg/ml）组与齐墩果酸①、②、③、④（5、10、20、40 µmol/L）组。按“2.2”项下方法接种96孔板，加入相应药液，预培养16 h后，除正常对照组外其余组加入终质量浓度为100 µg/ml ox-LDL继续培养24 h，用CCK-8法检测并计算各组细胞存活率。收集各组细胞，用PBS洗涤2次，加细胞裂解液，冰上裂解1 h，4 ℃下，以离心半径为9 cm、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，按试剂盒说明测定各组细胞内总蛋白及CAT、GSH-PX、NOS活性与NO含量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 复制模型细胞ox-LDL最适质量浓度的筛选

与0µg/ml比较，其余质量浓度下细胞存活率差异有统计学意义（P＜0.01）。IC50＝100 µg/ml，因此选取100 µg/ml ox-LDL作为复制HUVECs损伤模型的质量浓度。复制模型细胞ox-LDL最适质量浓度的筛选见表1。

表1 复制模型细胞ox-LDL最适质量浓度的筛选（，n＝6）Tab 1 Screening of optimal concentration of ox-LDL on model cell（，n＝6）

表1 复制模型细胞ox-LDL最适质量浓度的筛选（，n＝6）Tab 1 Screening of optimal concentration of ox-LDL on model cell（，n＝6）

与0µg/ml比较：＊P＜0.05vs.0µg/ml：＊P＜0.05

3.2 齐墩果酸最适浓度的筛选

与0 μmol/L比较，齐墩果酸浓度为60 μmol/L时细胞存活率降低，且随着齐墩果酸浓度的增高，细胞存活率逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，选择齐墩果酸浓度0～40 μmol/L范围内进行以下试验。齐墩果酸最适浓度的筛选见图1。

图1 齐墩果酸最适浓度的筛选（，n＝6）与0 μmol/L比较：＊P＜0.05；与60 μmol/L比较：#P＜0.05；与80 μmol/L比较：ΔP＜0.05Fig 1 Screening of optimal concentration of oleanolic acid（，n＝6）vs.0 μmol/L：＊P＜0.05；vs.60 μmol/L：#P＜0.05；vs.80 μmol/L：ΔP＜0.05

3.3 齐墩果酸对模型细胞存活率的影响

与正常对照组比较，模型组细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，齐墩果酸①、②、③、④组细胞存活率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中齐墩果酸④组比齐墩果酸①组细胞存活率高，差异有统计学意义（P＜0.05），证明40µmol/ml齐墩果酸有较强的抗氧化能力。齐墩果酸对模型细胞存活率的影响见表2。

3.4 齐墩果酸对模型细胞NO、NOS、CAT、GSH-PX水平的影响

与正常对照组比较，模型组细胞CAT、GSH-PX、NOS活性减弱，NO含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，齐墩果酸①、②、③、④组CAT、GSH-PX、NOS活性增强，NO含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。齐墩果酸对模型细胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影响见表3。

4 讨论

ox-LDL在AS的发展中起重要作用[7]。经氧化修饰而成的ox-LDL水平，已成为临床心脑血管病的一个重要生化标志[7]。Fu R等[8]研究发现，ox-LDL作用内皮细胞24 h后，细胞中的F肌动蛋白（F-actin）被破坏，导致内皮细胞对脂质成分的通透性增加，刺激活性氧（ROS）过度生成，诱导氧化应激，造成细胞氧化损伤，此时机体开启抗氧化系统，促进了GSH-PX、CAT等抗氧化酶合成[9]。这些抗氧化酶通过清除ROS，发挥抑制氧化损伤的作用[10-11]。本研究以ox-LDL刺激HUVECs复制AS模型，模型组HUVECs细胞存活率明显降低，GSH-PX与CAT活性明显下降，表明ox-LDL通过抑制GSH-PX与CAT活性，诱导氧化损伤。给予齐墩果酸预处理，能够明显提升HUVECs细胞活力，且GSH-PX与CAT的活力明显增强。提示齐墩果酸通过提高抗氧化酶GSH-PX、CAT活性，减轻ox-LDL对HUVECs细胞的氧化损伤，能有效抑制AS进展。齐墩果酸提高抗氧化酶活性的作用，可能与其富含不饱和基团的三萜类物质结构有关[12]。

表2 齐墩果酸对模型细胞存活率的影响（，n＝6）Tab 2 Effects of OA on survival rate of damaged cell（，n＝6）

表2 齐墩果酸对模型细胞存活率的影响（，n＝6）Tab 2 Effects of OA on survival rate of damaged cell（，n＝6）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与齐墩果酸①组比较：ΔP＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05；vs.oleanolic acid ①group：ΔP＜0.05

表3 齐墩果酸对模型细胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影响（，n＝6）Tab 3 Effects of OA on the levels of CAT，GSH-PX，NO and NOS in damaged cell（，n＝6）

表3 齐墩果酸对模型细胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影响（，n＝6）Tab 3 Effects of OA on the levels of CAT，GSH-PX，NO and NOS in damaged cell（，n＝6）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

正常情况下，内皮细胞中由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化产生血管内皮舒张因子NO[13]。NO通过调控四氢生物蝶呤（BH4），降低体内ROS含量[14]，起到保护内皮细胞免于氧化侵袭的作用。本研究对细胞中NO含量以及NOS活性进行测定，发现ox-LDL损伤的HUVECs细胞中，NO含量减少，NOS活性降低，表明NO和NOS作为抗氧化因子，在HUVECs细胞氧化损伤中受到抑制。经过齐墩果酸预处理，这两项指标均有不同程度的升高，证实齐墩果酸通过激活NOS，促进NO生成，保护HUVECs细胞。最近，Gkaliagkousi E等[15]研究发现，ox-LDL可以显著抑制内皮细胞、巨噬细胞NO合成酶基因表达，从而抑制NO合成。齐墩果酸提升NO和NOS的内皮保护作用，是由于NO对ROS的直接清除作用，还是涉及到NOS的基因调控，仍需进一步研究证实。

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