三七皂苷长循环纳米粒的肠吸收及药动学研究

赵国巍，陈绪龙，梁新丽，廖正根#，王春柳，招丽君，曹运朝（.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004；.九江学院临床医学院，江西九江 33000）

三七皂苷（PNS）为中药三七的主要有效部位，含有R1、Rg1和Rb1等多种活性成分。研究表明，PNS具有保护心肌缺血引起的损伤，对中枢神经系统具有镇静作用，同时还具有良好的抗炎和扩张血管等多种药理作用[1-2]。当前，PNS主要用于治疗冠心病、心绞痛、中风和动脉粥样硬化等。然而，PNS是易溶解、难渗透的药物，在胃肠道中不稳定，其口服给药后生物利用度低[3-6]。纳米粒能够提高药物的稳定性和渗透性，但纳米粒主要集中在单核巨噬细胞丰富的器官，对于靶部位不在这些器官的药物，长循环纳米粒（LCN）技术可以解决这些问题。

本研究组在前期已经制备了PNS-LCN，并对其理化性质进行了表征[7-8]，本研究旨在考察PNS-LCN的肠吸收及药动学。由于本研究以复乳化-溶剂挥发法制备PNS-LCN的过程中采用了壳聚糖（Cs）水溶液作为外水相，Cs是一种常用的吸收促进剂，因此同时比较研究了PNS-Cs的肠吸收及药动学行为。

1 材料

1.1 仪器

6410 triple quadrupole液质联用系统（美国Agilent公司）；HH-CP型CO2培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；18K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；XW-80A型微型涡流混合仪（上海沪西分析仪器厂）；BT-2000型氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

三七皂苷（西昌市杰象药物原料有限公司，R1、Rg1、Rb1质量分数分别为8.16%、27.87%、31.15%）；R1对照品（批号：110745-200414）、Rg1对照品（批号：110745-200320）、Rb1对照品（批号：110704-200318）均购自中国食品药品检定研究院；壳聚糖（浙江金壳生物化学有限公司，脱乙酰度：60%，黏度：26 mPa·s）；肝素钠（分析纯，上海惠兴生化试剂有限公司）；PNS-LCN[笔者自制，PNS的包封率为（53.93±0.69）%，载药量为（13.48±0.17）%]；Krebs溶液，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

2 方法

2.1 大鼠外翻肠囊实验[9-10]

2.1.1 外翻肠囊模型药液的制备 以Krebs液为溶剂，分别制备PNS质量浓度为0.72 mg/ml的PNS液、PNS-LCN液和PNS-壳聚糖物理混合液（Cs）液，作为供药体系。

2.1.2 大鼠外翻肠囊实验 18只SD大鼠禁食过夜（自由饮水），用3%戊巴比妥钠ip麻醉。分离十二指肠、空肠、回肠和结肠各约10 cm，用冰冷的Kerbs液洗净内容物，去除肠系膜，一端用细线扎紧，翻转肠管使黏膜面朝外，浆膜侧向内，另一端绑扎于取样口，用注射器从取样口向肠内注满空白Kerbs液2 ml得空白肠囊液，作为受药体系，然后将其放入到供药体系中。将整个装置放入37 ℃CO2培养箱中进行实验1 h。实验结束后，收集浆膜液，测量肠内径及长度，高效液相色谱（HPLC）法测定其中药物含量。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Kromasoil-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0～15 min，20%乙腈→21.5%乙腈；15～36 min，21.5%乙腈→40%乙腈）；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：203 nm；进样量：20 μl。

2.1.4 阴性考察 用空白Kerbs液作为供药体系，其余按“2.1.2”项下方法操作，即得空白肠囊液。按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。结果，Kerbs液对R1、Rg1和Rb1色谱峰无干扰。

2.1.5 R1、Rg1和Rb1浆膜液测定方法学的建立 精密吸取R1、Rg1、Rb1混合对照品（R1、Rg1、Rb1质量浓度分别为1 330、5 990、3 510 μg/ml）100 μl，加入900 μl Krebs液，制备R1质量浓度分别为13.3、26.6、53.2、87.8、133.0 µg/ml，Rg1质量浓度分别为55.9、111.8、223.6、368.9、559.0 µg/ml，Rb1质量浓度分别为35.1、70.2、140.4、231.7、351.0µg/ml的混合对照品溶液。以各对照品质量浓度（y）为纵坐标，相应峰面积积分值（x）为横坐标，进行线性回归，得R1、Rg1、Rb1回归方程分别为y＝4.462 4x+

2.5979（r＝0.999 3）、y＝7.686 6x+40.319（r＝0.999 9）、y＝8.063 6x+20.341（r＝0.999 9）。结果表明，R1、Rg1、Rb1质量浓度分别在13.3～133 µg/ml、55.9～559 µg/ml、35.1～351 µg/ml范围内与其相应峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.6 准确度与精密度试验 取空白肠囊液，制备低、中、高质量浓度的标准质控样品各5份（R1质量浓度分别为13.3、133、1 330µg/ml，Rg1质量浓度分别为55.9、559、5 590µg/ml，Rb1质量浓度分别为35.1、351、3 510µg/ml），按“2.1.3”项下色谱条件测定日内精密度（6次）、日间精密度（6次）、准确度（6次）。结果，日内和日间精密度RSD分别为5.5%和6.7%，准确度在93.6%～104.1%之间，均符合试验要求。

2.1.7 回收率试验 在标准曲线范围内，选择低、中、高质量浓度，制备R1、Rg1和Rb1的肠囊液对照品溶液，同时制备相同质量浓度以50%甲醇为基质的对照品溶液，测定回收率。低、中、高质量浓度下R1的回收率分别为95.8%、93.5%、94.1%，Rg1的回收率分别为94.7%、95.0%、95.0%，Rb1的回收率分别为91.7%、95.8%、96.2%。

2.1.8 稳定性试验 分别取Krebs液和空白肠囊液加入一定量PNS制备成给药药液，37 ℃下，CO2培养箱中于0、1、2、3 h分别取样测定。结果，R1、Rg1、Rb1在Krebs液中的降解残存率分别为（101.3±1.2）%、（102.9±0.8）%、（103.3±1.2）%（n＝3），在空白肠囊液中的降解残存率分别为（98.5±3.2）%、（96.9±3.8）%、（95.3±2.1）%（n＝3），表明R1、Rg1、Rb1在Krebs液和空白肠囊液中稳定。

2.2 药动学研究

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasoil-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱（0～9 min，28%乙腈→42.4%乙腈；9～12 min，42.4%乙腈→95%乙腈）；流速：0.4 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2.2 质谱条件 离子源：ESI；离子化模式：正离子；毛细管电压：3.5 kV；毛细管出口电压：－130 V；干燥温度：350 ℃；干燥气流速：10.0 L/min；雾化温度：425 ℃；喷雾器压力：40.0 psi；延迟时间：200 ms；定量模式：多反应监测模式（MRM）。MRM参数见表1。

表1 MRM参数Tab 1 MRM parameters

2.2.3 血浆样品的处理 取大鼠血浆200 μl，加入三七皂苷混合对照品溶液（同“2.1.5”项下）10 μl，涡旋混合，加入甲醇400 μl，涡旋，以离心半径为13.5 cm、8 000 r/min离心10 min，取上清液N2吹干，50%甲醇200 μl复溶，涡旋，以离心半径为13.5 cm、18 000 r/min离心10 min，取上清液进样。

2.2.4 方法学考察（1）方法专属性。分别取0.2 ml空白血浆、0.2 ml空白血浆+对照品、0.2 ml给药后大鼠血浆样品，按“2.2.3”项下方法处理血浆后，按“2.2.1”“2.2.2”项下色谱、质谱条件进样测定。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰血浆中待测组分R1、Rg1和Rb1测定。液相色谱-串联质谱见图1。（2）标准曲线的制备。取200µl空白血浆依次加入10 µl R1、Rg1、Rb1混合对照品系列溶液（同“2.1.5”项下），按“2.2.3”项下方法处理血浆后按“2.2.1”“2.2.2”项下色谱、质谱条件进样测定。以各对照品质量浓度（x）为横坐标，相应峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得R1、Rg1、Rb1回归方程分别为y＝39 709x－4 060.5（r＝0.998 4）、y＝32 774x+6 107.2（r＝0.999 2）、y＝25 747x+23 848.8（r＝0.999 6）。结果表明，R1、Rg1、Rb1质量浓度分别在1.3～1 300 µg/ml、2.5～1 500µg/ml、2.7～2 160µg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。（3）准确度与精密度试验。取空白血浆200 μl，按“2.2.3”项下方法制备血浆样品R1质量浓度分别为13.3、133、1 330µg/ml，Rg1质量浓度分别为55.9、559、5 590 µg/ml，Rb1质量浓度分别为35.1、351、3 510 µg/ml，每个质量浓度点5份样品连续测定3 d。结果表明，R1、Rg1和Rb1的日内、日间精密度的RSD分别为10.9%和12.1%，准确度均在85%～110%之间，符合相关要求。（4）回收率试验。在标准曲线范围内，选择低、中、高质量浓度，制备R1、Rg1和Rb1的血浆样品作为标准溶液样品，同时制备相同质量浓度以50%甲醇为基质的标准溶液，测定回收率。结果，低、中、高质量浓度下R1回收率分别为90.8%、85.3%、82.0%，Rg1的回收率分别为92.2%、85.4%、85.0%，Rb1回收率分别为90.2%、82.6%、82.6%。（5）稳定性试验。将“2.2.4（4）”项下血浆样品进行－20 ℃反复冻融3次，结果RSD≤10%；取“2.2.4（4）”项下含药血浆样品，4 h内每隔0.5 h进样1次，结果保留时间与峰面积均保持稳定，峰面积的RSD≤2%。

图1 液相色谱-串联质谱图A.空白血浆；B.空白血浆+对照品；C.血浆样品Fig 1 LC-MS/MS chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+sreference substance；C.plasma sample

由以上数据可见，R1、Rg1和Rb1血浆样品在储存、处理及测定过程中均保持稳定。经过验证，该分析方法符合生物样品测定的要求。

2.2.5 药液的制备 以水为溶剂，制备PNS质量浓度为60 mg/ml的PNS、PNS-LCN和PNS-Cs。

2.2.6 动物给药方案 18只SD大鼠随机分为A、B、C组，实验前禁食过夜（自由饮水）。将A、B、C组大鼠分别按照1 000 mg/kg剂 量ig PNS、PNS-LCN和PNS-Cs。于给药后0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120 h经眼底静脉丛取血约0.5 ml，置于肝素化试管中，立即以离心半径为13.5 cm、3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆，按2.2.3项下方法处理血浆，按“2.2.1”“2.2.2”项下色谱质谱条件进样测定R1、Rg1和Rb1含量。

2.2.7 数据处理 采用DAS ver2.0药动学智能分析软件计算药动学参数。

3 结果

3.1 外翻肠囊法研究PNS在大鼠各肠段的吸收

采用渗透系数（Papp，10－9cm/s）评价PNS、PNS-LCN和PNS-Cs中R1、Rg1和Rb1在各肠段的吸收，计算公式如下：Papp＝（dQ/dt）/（A×c0）。其中，Papp为化合物的表观渗透系数；dQ/dt为单位时间内药物转运量；c0为供液体系中药物的质量浓度（µg/ml）；A为肠面积（cm2）。R1、Rg1和Rb1在不同肠段的Papp见表2。

表2 R1、Rg1和Rb1在不同肠段的Pap（p10－9 cm/s，，n＝6）Tab 2 Papp ofR1，Rg1andRb1indifferent intestinal segment（s10－9 cm/s，，n＝6）

表2 R1、Rg1和Rb1在不同肠段的Pap（p10－9 cm/s，，n＝6）Tab 2 Papp ofR1，Rg1andRb1indifferent intestinal segment（s10－9 cm/s，，n＝6）

与PNS比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs PNS：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

由表2可知，PNS中的R1、Rg1和Rb1在十二指肠、空肠、回肠和结肠中均有不同程度吸收。将PNS包入LCN或Cs混合之后，R1、Rg1和Rb1在不同肠段的Papp均有不同程度增加。其中，PNS-LCN中R1在十二指肠和空肠，Rg1在空肠和回肠，Rb1在回肠和结肠的Papp与PNS中相应的数值比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；PNS-Cs中R1在十二指肠，Rg1在十二指肠、空肠和回肠，Rb1在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Papp与PNS中相应数值比较差异有统计意义（P＜0.01或P＜0.05）。

3.2 药动学研究

浓度-时间曲线见图2；R1、Rg1和Rb1药动学参数见表3～表5。

图2 浓度-时间曲线（n＝6）A.R1；B.Rg1；C.Rb1Fig 2 Plasma concentration-time curves of R1，Rg1and Rb1after oral administration of PNS，PNS-LCN和PNS-C（sn＝6）A.R1；B.Rg1；C.Rb1

PNS-LCN和PNS-Cs中R1、Rg1、Rb1AUC（0-t）分别为PNS的3.65、3.63、2.96倍和0.31、0.77、1.36倍；PNS-LCN中R1、Rg1和Rb1的MRT、t1/2、tmax与PNS比较均明显延长；PNS-Cs中R1、Rg1的MRT（0-t）、t1/2、tmax与PNS比较均明显缩短；PNS-LCN中Rg1和Rb1的cmax、PNS-Cs中R1、Rg1、Rb1的cmax与PNS比较均明显增加。

表3 R1药动学参数（，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of R（1，n＝6）

表3 R1药动学参数（，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of R（1，n＝6）

与PNS比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs PNS：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表4 Rg1药动学参数（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of Rg（1，n＝6）

表4 Rg1药动学参数（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of Rg（1，n＝6）

与PNS比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs PNS：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表5 Rb1药动学参数（，n＝6）Tab 5 Pharmacokinetic parameters of Rb（1，n＝6）

表5 Rb1药动学参数（，n＝6）Tab 5 Pharmacokinetic parameters of Rb（1，n＝6）

与PNS比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs PNS：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

4 讨论

肠吸收实验结果表明，Cs对PNS中的活性成分R1、Rg1、Rb1均有不同程度的促吸收作用。Cs是一种常见的吸收促进剂，其对药物跨上皮黏膜细胞的透过能力有很强的促进作用，本实验结果与文献报道一致[11]。Cs能有效促进R1、Rg1和Rb1吸收，使得PNS-Cs中的PNS在血液中的tmax明显缩短，血药浓度明显增加，但同时使其在大鼠体内的滞留时间明显缩短，消除加快，因此PNS-Cs中R1、Rg1的生物利用度与PNS比较反而明显降低。

PNS-LCN能提高R1、Rg1、Rb1的生物利用度，可能是由于纳米粒的组织通过性良好，药物以纳米粒的形式吸收，提高了其渗透性；并且，可能由于PNS-LCN对胃肠道黏膜具有一定的黏附作用，延长药物在胃肠道的停留时间，增大吸收；同时，可能由于PNS-LCN表面修饰了聚乙二醇单甲醚-聚乳酸共聚物、Cs等亲水性和空间位阻较大基团，大大减少了单核巨噬细胞系统对纳米粒的吞噬作用，使PNS-LCN在体循环中长时间滞留，从而延长了药物的消除半衰期，克服了普通纳米粒易被单核巨噬细胞从体循环中迅速清除的缺点，进而明显提高了PNS的生物利用度[12-15]。由肠吸收和药动学研究可知，PNS-LCN在大鼠体内生物利用度与PNS比较明显提高，是LCN提高PNS渗透性和延长PNS在大鼠体内消除时间等综合作用的结果。

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