波棱瓜子提取物在大鼠体内分布的初步研究

陈璐，姚红娥，李春沁，何春杨，张梅

·药理毒理·

波棱瓜子提取物在大鼠体内分布的初步研究

陈璐，姚红娥，李春沁，何春杨，张梅

目的：初步了解波棱瓜子提取物在大鼠体内的组织分布情况，为进一步确定其药效成分及作用机制奠定基础。方法：大鼠单次灌胃给予一定剂量的波棱瓜子乙酸乙酯提取部位，分别在给药后1 h、2 h处死并解剖大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑六个组织；采用高效液相色谱法（HPLC）对比空白组织、给药组织及体外样品，对各组织中移行成分进行确定，了解波棱瓜子提取物中各成分在大鼠体内的分布状态。结果：大鼠给药后，肺出现了4个移行成分，心、肝组织中出现了两个移行成分，脾、肾组织在2 h出现了一个移行成分，脑组织中未有移行成分出现。结论：波棱瓜子提取物口服给药后，多种成分均有吸收。给药后1 h～2 h间，各脏器分布广泛，其中在肺脏中原型成分积蓄最多，肝脏中出现代谢成分，且药物进入肝、肺脏的速度较快；心、脾、肾中原型成分的积蓄较小，脑组织中未出现任何移行成分，该药似不能通过血脑屏障。

波棱瓜子；体内分布；HPLC

波棱瓜子为葫芦科波棱瓜属植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.（H. pedunculosum (Ser.) Baill）的干燥成熟种子，具有清腑热，胆热的功效，用于治疗肝、胆热症（肝炎，胆囊炎），消化不良等。现代药理研究表明波棱瓜子具有抗化学性肝损伤、抗氧化、抗疲劳及抗肿瘤等作用[1～6]。课题前期对波棱瓜子的血清药物化学进行了研究，初步确定了其血浆中的移行成分[7]。本研究在此基础之上进一步探讨波棱瓜子在大鼠各组织中的移行成分及分布，为研究波棱瓜子体内作用的有效成分、作用机制及代谢过程奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，18只，体重140～160g，购于成都达硕实验动物有限公司，动物合格证：SCXK（川）2008-24。

1.2 药材与试剂

波棱瓜子，2012年9月购于四川甘孜，经成都中医药大学药学院中药资源与鉴定系裴瑾教授鉴定为葫芦科植物波棱瓜Herpeto-spermum caudigerum Wall的干燥成熟种子。

甲醇 (成都市科龙化工试剂厂, 分析纯 )；甲醇(美国 Fisher公司, 色谱纯)； 高纯水 (实验室自制 )；乙腈 (色谱纯, 美国 Fisher公司)；磷酸（成都市科龙化工试剂厂, 分析纯）；蜂蜜（北京市慈生堂有限公司）。

1.3 仪器

安捷伦 1200高效液相色谱仪；KQ-500DE超声波清洗机 (昆山市超声波仪器有限公司)；TGL-16G高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) ； 微型旋涡混合仪 (上海沪西分析仪器长有限公司)；氮气吹干仪（HGC-1RA）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 波棱瓜子乙酸乙酯提取物的制备 根据课题前期研究结果制备供试品[7]：取波棱瓜子粗粉，用 95%乙醇于水浴回流提取 3次, 用 10、8、6倍乙醇分别提取2 h、1.5 h、1.5 h，减压除去乙醇得浸膏，冷却。将上层绿色油状物倾出，弃去，用石油醚洗涤色固体。水分散，用乙酸乙酯萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压除去乙酸乙酯，得黄色固体，即为乙酸乙酯提取物。

取波棱瓜子乙酸乙酯部位提取物用甲醇溶解配制成浓度为 1.0 mg．mL-1的溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，得波棱瓜子乙酸乙酯部位供试品溶液。另精密称定波棱瓜子乙酸乙酯部位适量，放入研钵中研细后，加入蜂蜜研磨混合，配制成0.375 g．mL-1的混悬液，4℃冷藏，备用。

2.1.2 实验动物分组及给药方案 将18只SD大鼠分为空白组、给药1 h组及给药2 h组，每组6只。禁食12 h (自由饮水 )，给药组灌胃“2.1.1”项下制备的波棱瓜子乙酸乙酯部位蜂蜜混悬液1 mL/100 g，空白组给予相同体积的蜂蜜。空白组和给药1 h组大鼠于灌胃后1 h处死，给药2 h组于灌胃后2 h处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑6个组织。用生理盐水洗净，吸干水分，每个组织称取0.5 g，分别加入3倍量的生理盐水制成组织匀浆。

2.1.3 组织样品的制备 取1 mL组织匀浆加入3倍量甲醇，析出蛋白沉淀，涡旋混匀5 min，离心（10000 r．min-1）15 min，取出上清液，用氮气吹干。加 100

μL色谱甲醇溶解剩余物，10000 r．min-1转速离心 5 min ，上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得组织供试品。

2.1.4 色谱条件 采用课题组前期研究建立方法[7]：Phenomenex Luna C18高效液相色谱柱 ( 4.60 mm ×250 mm, 5 μm)；柱温：25 ℃，检测波长:230 nm；流动相: A (乙腈) , B ( 0.1 %磷酸水溶液)：流速: 0.8 mL．min-1，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.1.5 波棱瓜子乙酸乙酯提取物及组织样品分析 取波棱瓜子乙酸乙酯提取物供试液10 μL、给药组织样品及空白组织样品各20 μL进样，在相同色谱条件下进行分析, 建立HPLC指纹图谱, 比较空白组织样品、给药组织样品以及体外波棱瓜子乙酸乙酯部位的色谱峰，鉴定组织中的移行成分，探讨各成分在组织中的分布状态。

2.2 结果

波棱瓜子提取物给药后大鼠心组织出现了2个移行成分（图1），与体外样品相比较可知，1、2号峰为波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，给药后以原型成分进入心脏。两个峰的峰面积均随着时间的推移有所增加，其中1号峰更为明显。肝组织中出现了2个移行成分（图2），与体外样品相比可知，2号峰为给药肝组织中出现的代谢成分；1号峰在空白肝组织、给药肝组织以及波棱瓜子乙酸乙酯部位样品中都有出现，但给药肝组织中该峰面积与空白肝组织相较明显增大，可能该峰是由药材中的某成分与组织中固有成分叠加而成，且2 h给药肝组织中该峰面积较1h给药肝组织稍有减小。给药后2 h脾组织中出现了移行成分（图3），与体外样品相比较可知，1号峰可能为给药后脾组织中的代谢成分，但由于该峰不是单峰，故不能进一步具体判断。肺组织出现了4个移形成分（图4），与体外样品相比较可知，1、2、3、4号峰均为波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，给药后以原型成分进入肺脏，且4个峰在给药2 h肺组织中峰面积均小于1 h肺组织。肾组织中出现1个移行成分（图5），与体外样品比较可知，1号峰为波棱瓜子乙酸乙酯部位中含有的成分，给药后以原型成分进入肾脏。脑组织中未发现移形成分（图6），波棱瓜子提取物中成分似不能透过血脑屏障。

图1 心组织HPLC图谱

图2 肝组织HPLC图谱

图3 脾组织HPLC图谱

图4 肺组织HPLC图谱

图5 肾组织HPLC图谱

图6 脑组织HPLC图谱

3 讨论

波棱瓜子提取物原型成分在给药后1 h-2 h间，在各脏器中分布广泛，其中在肺脏中原型成分积蓄最多，肝脏中出现代谢成分；心、脾、肾中原型成分的积蓄较小；脑组织中未出现任何移行成分，该药似不能通过血脑屏障。在给药后1 h-2 h间，肝脏与肺脏中移行成分含量减小，说明波棱瓜子提取物给药后活性成分进入肝、肺脏较快；心脏与脾脏中移行成分含量增加，说明活性成分进入心、脾脏较慢，且含量较低；给药2 h，肾脏出现原型成分，表明波棱瓜子进入血液的原型成分可能在2 h时已经开始排泄。

药物在体内的分布与药理作用有密切关系，它决定了药效的强弱和作用的持续时间。本研究表明，波棱瓜子给药肝脏出现移行成分，含量较心、脾、肾组织高，且活性成分进入较快，这一结果与波棱瓜子具有治疗肝胆热证的作用相符合。但是，结果同时表明波棱瓜子提取物中多种原型成分在肺脏中积蓄最多，这与波棱瓜子的传统藏医药理论，以及目前相关药理研究似乎无法联系。但药物分布与药理作用部位的直接关系不是绝对的，分布多的组织．也许并不是表现治疗作用的器官，药物亦可能在体内发生部分转化。所以还需进一步探索波棱瓜子发挥药理作用的本质，将其分布与活性成分的结构转化及作用机制研究结合进行。

此外，由于缺乏足够多的波棱瓜子各化学成分对照品，实验未能对各组织中移行成分进行指认及含量测定。拟在进一步研究中采用对照品对照、文献比对、TOF-MS精确分子量测定及数据库检索等方式对移行成分进行鉴定。

[1] 刘军,陈兴,张伊,等.藏药波棱瓜子乙酸乙酯部位化学成分研究[J].中药与临床,2010,1(3): 15.

[2] 方清茂,张浩,曹毓.藏药波棱瓜子提取物对肝损伤大鼠的抗氧化作用[J].华西药学杂志,2008, 23 (2) : 147.

[3] 曹琳,吴勤,袁海龙,等.肝能滴丸对免疫异常小鼠的保护作用[J]．解放军药学学报,2005,21(3):227.

[4] Yuan Hai-Long, Yang Ming, LI Xian-Yi, You Rong-Hui. Hepatitis B Virus Inhibiting Constituents from Herpetospermum caudigerum[J]. Chem. Pharm. Bull, 2006, 54(11):1592.

[5] 韩玉梅,李正明,袁海龙,等.肝能滴丸在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果[J].中国实验方剂学杂志,2006,4(12) :43.

[6] 谭睿,石雪蓉.藏药色吉美多提取物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响[J].世界科学技术-中医药现代化•民族医药学,2005,第7卷增刊:68.

[7] 刘军,陈兴,张伊,等.藏药波棱瓜子的血清药物化学初步研究[J].成都中医药大学学报,2010,33(2):93.

（责任编辑：陈思敏）

Preliminary study on the distribution of Bolengguazi extract in rats

CHEN Lu, YAO Hong-e, LI Chun-qin, HE Chunyang, ZHANG Mei//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:To preliminary investigate the distribution of Bolengguazi extract in rats, and laid the foundation for further research of effective material base and action mechanism.Method:At 1 hour and 2 hours after single dose of Bolengguazi extract was intragastric administered, the rats were executed. The heart, liver, spleen lung, and kidney of rats were collected. Highperformance liquid chromatography ( HPLC ) was used to detect the compounds in tissues by comparing tissue of control group, tissue of group with Bolengguazi and Bolengguazi extract.Result:There were 4 compounds detected in lungs tissue, 2 compounds detected in heart and liver tissue, 1 compound detected in spleen and kidney tissue at 2h, and no compound was detected in brain tissue.Conclusion:There are many components of Bolengguazi absorbed in rats after intragastric administration. At 1 to 2 hour, the components are distributed widely. Higher content of original compounds are found in lungs tissue and metabolites are found in liver tissue. Lower content of original compounds are found in heart, spleen and kidney. And no compound appears in brain tissue, so the medicine is unable to pass the blood-brain-barrier.

Bolengguazi; tissue distribution; HPLC

R 285.5

A

1674-926X(2014)01-008-03

四川省科技支撑项目（2013SZ0114）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

陈璐(1990-)，女，药物分析专业硕士研究生

张梅，教授，博士生导师，主要从事中药及其复方物质基础及质量标准化研究Tel:028-61800231 Email: zhangmei63@126.com

2013-06-03